兩種β2-受體激動劑熒光免疫快速檢測 試紙條的制備及評價

◎ 周 芳，盧俊諭，王帥兵，崔瀟婷，卜國瑞，靳世杰

（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300）

萊克多巴胺（Ractopamine，RAC）、沙丁胺醇（Salbutamol，SAL）屬于β2-腎上腺素受體激動劑，俗稱瘦肉精，該類物質(zhì)可使多種動物體內(nèi)的營養(yǎng)成分由脂肪組織向肌肉組織轉(zhuǎn)移，曾被廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖，有減少脂肪含量、提高瘦肉率的效果。但是過多攝入含此類物質(zhì)的食物，可導(dǎo)致急、慢性中毒，心率失常等，引發(fā)惡性疾病[1-2]。目前，我國已明文規(guī)定禁止使用瘦肉精用于動物養(yǎng)殖，但仍有不法商家為追求利益而違法使用。

目前，該類瘦肉精的檢測方法較多。①液相色譜、液相色譜與質(zhì)譜法串聯(lián)使用是國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法[3-6]，但是此類方法需要昂貴的設(shè)備，且前處理方法復(fù)雜，操作煩瑣費時，需要專業(yè)人士操作等，所以適用于具有一定實力的監(jiān)管部門，并不適用于基層執(zhí)法及食品加工產(chǎn)業(yè)鏈相關(guān)企業(yè)的自我品質(zhì)控制。②酶聯(lián)免疫吸附法[7]具有通量高、易于自動化等優(yōu)點，很適合大規(guī)模的養(yǎng)殖場，缺點是需要專業(yè)人員操作，且需要積累到一定的樣本量，否則容易造成浪費。③膠體金法[8]具有操作簡便、檢測快速等優(yōu)點，缺點是靈敏度欠缺。

近十幾年來，基于熒光免疫層析法在人醫(yī)臨床檢驗領(lǐng)域得到了長足的發(fā)展和大規(guī)模的應(yīng)用，兼具操作簡便、靈敏度高等優(yōu)點，但在獸藥殘留領(lǐng)域應(yīng)用的并不多[9-12]。目前使用的熒光免疫層析方法更多的是基于熒光微球，本研究擬以熒光染料為標(biāo)記物，探索一種制備工藝簡單且同時對萊克多巴胺、沙丁胺醇進(jìn)行聯(lián)合檢測的試紙條，便于規(guī)?；a(chǎn)，實現(xiàn)一次檢測兩種瘦肉精殘留，提高檢測速度，同時也為基于熒光免疫的其他檢測產(chǎn)品的研究與探索提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品，購自中國食品藥品檢定研究院；萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品，購自廣州優(yōu)抗多公司；萊克多巴胺抗原、萊克多巴胺抗體、沙丁胺醇抗原、沙丁胺醇抗體，均購自廣州優(yōu)抗多公司；熒光染料CF647，購自biotium公司；羊抗兔IgG、兔IgG，均購自杭州隆基生物；牛血清白蛋白（BSA）、Tween-20、聚乙二醇2000（PEG20000）、二甲基亞砜（DMSO），均購自國藥試劑；硝酸纖維素膜（NC膜），購自Sartorius公司；玻璃纖維、吸水紙、聚酯纖維、PVC底板、檢測卡殼，購自上海捷寧公司；空白豬尿，收集于本地屠宰場。

1.2 主要儀器

HM3030劃膜噴金儀、ZQ2002斬切機，均購自上海金標(biāo)公司；AFS-1000熒光免疫分析儀，購自廣州藍(lán)勃公司；DHG-9000鼓風(fēng)干燥箱、DZF-6050真空干燥箱，均購自上海恒一公司；UV-3300分光光度計，購自上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.3 試紙條的制備

1.3.1 熒光抗體標(biāo)記物的制備

取200 μg萊克多巴胺抗體，加入0.1 ng·mL-1碳酸氫鈉溶液（pH為8.3）稀釋至100 μL，濃度為2 mg·mL-1；將熒光染料CF 647溶解在DMSO中，使其濃度為10 μmol·mL-1，向抗體溶液中加入 20 μL 的熒光染料CF 647溶液，室溫孵育1.5 h。沙丁胺醇抗體、兔IgG抗體均使用相同的標(biāo)記方式進(jìn)行標(biāo)記。

在100 mL的0.01 mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液（PBS）中用透析膜透析標(biāo)記后的抗體，12 h更換一次透析液，共透析3次。取透析后的熒光抗體3 μL，用300 μL的PBS稀釋100倍，測定在200～700 nm的吸收度，記錄最大吸光值，采用公式（1）計算標(biāo)記率。

式中，A650為熒光染料在650 nm附近的最大吸光峰處的吸光度值，A280為熒光標(biāo)記抗體在280 nm附近的最大吸光峰處的吸光度值。

1.3.2 結(jié)合墊制備

使用含1% BSA、0.05% Tween-20、0.02% PEG20000的PBS對標(biāo)記后的抗體進(jìn)行稀釋，萊克多巴胺抗體標(biāo)記物稀釋到0.015 mg·mL-1，沙丁胺醇抗體標(biāo)記物稀釋到 0.01 mg·mL-1，兔 IgG 標(biāo)記物稀釋到 0.005 mg·mL-1。以6 μL·cm-1的噴量將稀釋后的標(biāo)記物噴點于聚酯纖維墊上，即為結(jié)合墊，放置真空干燥箱中干燥12 h。

1.3.3 NC膜的包被

分別將萊克多巴胺和沙丁胺醇抗原用含1%蔗糖的PBS稀釋成1 mg·mL-1的抗原溶液，用劃膜噴金儀以1 μL·cm-1的噴量將抗原劃線在NC膜上，為檢測線，兩種抗原的檢測線間隔0.4 cm。將羊抗兔IgG用含1%蔗糖的PBS稀釋成0.5 mg·mL-1的溶液，靠近最末端檢測線外0.4 cm處劃控制線，于鼓風(fēng)干燥箱中37 ℃干燥4 h。

1.3.4 試紙條制備

在PVC底板上先后粘貼包被后的NC膜、結(jié)合墊、樣品墊、吸水紙。使用斬切機將粘貼好的大板切割成寬度為0.4 cm的試紙條，將試紙條裝入檢測卡殼中即為檢測卡。

1.3.5 檢測方法

檢測在室溫下進(jìn)行，取80 μL檢測樣品滴加到檢測卡加樣孔中，水平放置，在層析作用下，反應(yīng)復(fù)合物沿著NC膜向前移動，包被在膜上的抗原與樣本中的萊克多巴胺、沙丁胺醇競爭結(jié)合熒光標(biāo)記的抗體，樣本中所含萊克多巴胺、沙丁胺醇越多，膜上聚集的復(fù)合物則越少，熒光信號強度越弱；室溫反應(yīng)10 min后，將檢測卡插入熒光免疫分析儀中讀取檢測卡上的熒光信號，計算相應(yīng)項目的檢測線信號與控制線信號的比值（T/C），與檢測卡芯片中內(nèi)置的臨界T/C做比較，低于臨界T/C的樣本為陽性樣本，高于臨界T/C的樣本為陰性樣本，從而判斷樣本中是否含有萊克多巴胺、沙丁胺醇。

1.4 試紙條性能評價

1.4.1 萊克多巴胺濃度與T/C關(guān)系曲線測定

取萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品，用空白豬尿配制為0 ng·mL-1、0.5 ng·mL-1、1 ng·mL-1、2 ng·mL-1和 4 ng·mL-1系列濃度的樣本，按1.3.5的方法，考察檢測萊克多巴胺的濃度與檢測T/C的關(guān)系。

1.4.2 沙丁胺醇濃度與T/C關(guān)系曲線測定

取沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品，用空白豬尿配制為0 ng·mL-1、0.5 ng·mL-1、1 ng·mL-1、2 ng·mL-1、4 ng·mL-1系 列 濃度的樣本，按1.3.5的方法，考察檢測沙丁胺醇的濃度與檢測T/C的關(guān)系。

1.4.3 檢出限的確定

按1.3.5的方法，檢測萊克多巴胺濃度為0 ng·mL-1、0.5 ng·mL-1、1 ng·mL-1、2 ng·mL-1的樣本各 30 份，檢測沙丁胺醇濃度為 0 ng·mL-1、0.5 ng·mL-1、1 ng·mL-1、2 ng·mL-1的樣本各30份，計算陰性樣本的檢測T/C均值減3倍標(biāo)準(zhǔn)差，計算陽性樣本的檢測T/C均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)差，陰性樣本的T/C均值減3倍標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)該大于某濃度樣本的T/C均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)差，則此濃度為本試紙條的檢出限。

1.4.4 重復(fù)性檢測

按1.3.5的方法，檢測萊克多巴胺和沙丁胺醇為陰性的樣本各30份，檢測萊克多巴胺和沙丁胺醇濃度為1 ng·mL-1陽性樣本各30份，計算試紙條的變異系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光標(biāo)記率

在波長200～700 nm范圍內(nèi)，萊克多巴胺抗體、沙丁胺醇抗體、兔IgG的熒光標(biāo)記物溶液在280 nm、650 nm處的最大吸光值如表1所示。熒光免疫層析試劑中，抗體上標(biāo)記的熒光染料個數(shù)是關(guān)鍵參數(shù)，標(biāo)記個數(shù)太少容易導(dǎo)致熒光信號偏弱，標(biāo)記個數(shù)太多容易影響抗體活性。熒光染料標(biāo)記抗體試驗中通常為一個抗體上標(biāo)記3～7個熒光染料，本試驗抗體上標(biāo)記的熒光染料個數(shù)在5～6個，為較佳標(biāo)記個數(shù)。

表1 熒光標(biāo)記率結(jié)果表

2.2 萊克多巴胺濃度與T/C相關(guān)性

萊克多巴胺樣本在不同濃度時，其劑量與T/C值的相關(guān)性如圖1所示，隨著濃度的升高，萊克多巴胺的T/C值降低，呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)。

圖1 萊克多巴胺濃度與T/C相關(guān)性圖

2.3 沙丁胺醇濃度與T/C相關(guān)性

沙丁胺醇樣本在不同濃度時，其劑量與T/C值的相關(guān)性如圖2所示，隨著濃度的升高，沙丁胺醇的T/C值降低，呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)。

圖2 沙丁胺醇濃度與T/C相關(guān)性圖

2.4 檢出限

萊克多巴胺、沙丁胺醇30份陰性樣本和不同濃度陽性樣本T/C的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差（SD）、3倍標(biāo)準(zhǔn)差（3SD）見表2、表3。從表2可知，萊克多巴胺陰性樣本的T/C均值減3SD小于0.5 ng·mL-1樣本的T/C均值加3SD，但是大于1 ng·mL-1樣本的T/C均值加3SD，即說明萊克多巴胺的檢出限可達(dá)到1 ng·mL-1。從表3可知，沙丁胺醇陰性樣本的T/C均值減3SD小于0.5 ng·mL-1樣本的T/C均值加3SD，但是大于1 ng·mL-1樣本的T/C均值加3SD，即說明沙丁胺醇的檢出限可達(dá)到 1 ng·mL-1。

表2 萊克多巴胺不同濃度樣本檢測T/C結(jié)果表（n=30）

表3 沙丁胺醇不同濃度樣本檢測T/C結(jié)果表（n=30）

2.5 重復(fù)性

檢測萊克多巴胺、沙丁胺醇的陰性樣本和1 ng·mL-1陽性樣本的結(jié)果如表4所示，免疫層析檢測產(chǎn)品重復(fù)性的CV通常在15%～25%，由結(jié)果可知本試劑盒檢測結(jié)果重復(fù)性良好。

表4 重復(fù)性檢測結(jié)果表（n=30）

3 結(jié)論

動物體內(nèi)的萊克多巴胺、沙丁胺醇、鹽酸克倫特羅等這類瘦肉精殘留的檢測方法較多，常規(guī)的國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法高效液相色譜法準(zhǔn)確但是處理煩瑣，檢測費用昂貴；隨著快速檢測技術(shù)的發(fā)展，陸續(xù)開發(fā)出一些新型快速的檢測方法，酶聯(lián)免疫檢測法、膠體金快速檢測法、熒光免疫快速檢測法等，每種方法各有其優(yōu)缺點，在眾多的方法中可以根據(jù)實際情況，選取滿足合適的方法進(jìn)行檢測；這些快速檢測方法能夠快速篩查出可疑樣品，有針對性地采樣，提高實驗室檢測的針對性和準(zhǔn)確性，提高監(jiān)管的效率和檢驗工作。

本試驗探索了熒光免疫層析檢測試紙條的一種簡易制備方法，用熒光染料代替?zhèn)鹘y(tǒng)熒光微球直接標(biāo)記抗體并制備了萊克多巴胺和沙丁胺醇二聯(lián)檢測免疫層析試紙條，對試紙條的性能做了初步的評價，檢測限可達(dá)1 ng·mL-1，精密度符合要求，具有靈敏度高，檢測速度快的特點，通過熒光定量儀讀取結(jié)果，使用方便快捷。

隨著國家對食品安全監(jiān)管的加強及人們食品安全意識的提高，對食品安全領(lǐng)域快速檢測技術(shù)的發(fā)展要求也越發(fā)強烈，試驗中探索的熒光素直接標(biāo)記方法制備瘦肉精熒光免疫快速檢測的試劑條，具有制備方法簡易、成本相對低廉等優(yōu)勢，適合大規(guī)模生產(chǎn)，有利于促進(jìn)快速檢測技術(shù)理念在食品安全領(lǐng)域的推廣，保障老百姓的食品安全。