一測(cè)多評(píng)法同步測(cè)定鉤藤飲片中3種黃烷類成分的含量

胡新華，陳玩珊，原文鵬

(深圳市人民醫(yī)院<暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，南方科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院>藥學(xué)部，廣東 深圳 518020)

鉤藤來源于茜草科植物鉤藤[Uncariarhynchophylla(Miq.)Miq.ex Havil.]、大葉鉤藤(UncariamacrophyllaWall.)、毛鉤藤(UncariahirsutaHavil.)、華鉤藤[Uncariasinensis(Oliv.)Havil.]或無柄果鉤藤(UncariasessilifructusRoxb.)的干燥帶鉤莖枝。秋、冬二季采收，去葉，切段，曬干[1]。具有息風(fēng)定驚、清熱平肝之功效。常用于肝風(fēng)內(nèi)動(dòng)、驚癇抽搐、高熱驚厥、感冒夾驚、小兒驚啼、妊娠子癇、頭痛眩暈。研究表明，鉤藤中的生物堿類成分能夠抑制外周血管收縮，使血管阻力降低，血壓降低，同時(shí)有抗血小板聚集和抗血栓的作用，臨床上用于降血壓[2]。目前對(duì)該類成分的含量測(cè)定已多有報(bào)道。另一類黃烷類成分包括兒茶素、表兒茶素、原花青素B2等成分含量測(cè)定的報(bào)道則少有關(guān)注。因該類成分近年因廣泛的生物活性[3-9]被更多關(guān)注，并且考慮到B型原花青素對(duì)照品的不易得和穩(wěn)定性較差的問題，該類成分的含量測(cè)定最優(yōu)選擇為一測(cè)多評(píng)法(QAMS)。一測(cè)多評(píng)法[10]采用只測(cè)定藥材或制劑中某個(gè)代表性成分(易得、價(jià)廉、有效、穩(wěn)定)，同時(shí)又可計(jì)算其他待測(cè)成分的含量，可有效克服對(duì)照品短缺等問題，還能對(duì)藥材或制劑進(jìn)行多指標(biāo)質(zhì)量控制。對(duì)此，本文應(yīng)用一測(cè)多評(píng)法實(shí)現(xiàn)對(duì)鉤藤飲片的多指標(biāo)質(zhì)量控制，即應(yīng)用其中一個(gè)對(duì)照品(兒茶素)建立該成分與其余待測(cè)成分(表兒茶素、原花青素B2)間的相對(duì)校正因子，對(duì)鉤藤飲片中黃烷類成分的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 安捷倫 1260 高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；Mettler Toledo Ms 十萬分之一電子天平(德國梅特勒公司)；KQ-500DE 超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；DLSB-5/20 低溫冷卻循環(huán)泵(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 試劑試藥 甲醇、乙腈，色譜純；乙醇、石油醚(30～60 ℃)、乙酸乙酯為分析純，水為雙蒸水。

對(duì)照品：兒茶素(含量測(cè)定用，深圳健竹生物科技有限公司，批號(hào):20170205，純度 99.48%)；表兒茶素(含量測(cè)定用，深圳健竹生物科技有限公司，批號(hào):20160930，純度 98.83%)；原花青素 B2對(duì)照品(自制，純度≥98.13%)。

藥材飲片：鉤藤飲片來自深圳市人民醫(yī)院中藥房，共 10 個(gè)批次，產(chǎn)地分別為廣西、云南和湖南。

2 方法與結(jié)果

2.1 一測(cè)多評(píng)方法學(xué)考察

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Agilent Eclipse Plus C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：水(A)-甲醇(B)；采用梯度洗脫程序，流動(dòng)相比例為：0～30 min，10%B→47%B；30～35 min，47%B→90%B。流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm。上述色譜條件下,各組分分離度良好。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取兒茶素對(duì)照品、表兒茶素對(duì)照品及原花青素B2對(duì)照品適量，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，得兒茶素、表兒茶素及原花青素B2分別為0.68、0.62、0.65 mg·mL-1的對(duì)照品溶液，備用。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密稱取鉤藤細(xì)粉約10.00 g，加入100 mL乙醇超聲提取30 min，過濾，濾液減壓蒸干，加入100 mL蒸餾水超聲分散，水溶液轉(zhuǎn)移至250 mL的分液漏斗中，加入石油醚(30～60 ℃)50 mL，萃取，棄去石油醚層，水層繼續(xù)加50 mL乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯層，減壓蒸干，用甲醇少量多次將樣品轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，定容至刻度，搖勻，即得。

2.1.4 線性和范圍 精密吸取上述混合對(duì)照品溶液2、4、6、8、10 μL,進(jìn)樣分析,每個(gè)濃度進(jìn)樣2次,取平均值。以進(jìn)樣量對(duì)峰面積積分值進(jìn)行回歸,兒茶素、原花青素B2、表兒茶素的標(biāo)準(zhǔn)曲線見表1。

表1 各檢測(cè)成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

2.1.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取兒茶素、原花青素B2、表兒茶素供試品溶液10 μL連續(xù)進(jìn)樣6次,以測(cè)得的峰面積響應(yīng)值作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，得到3種成分的RSD分別為 1.2%、1.5%、1.9%，表明儀器精密度良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別取供試品 3、4、9，按照“2.1.3”項(xiàng)下方法操作，得到供試品溶液，分別于配制后的 0、2、4、6、8、12 和 24 h 取 10 μL進(jìn)樣測(cè)定峰面積,兒茶素、原花青素B2和表兒茶素在24 h內(nèi)峰面積的RSD分別為1.1%、1.6%、1.4%。表明處理后的樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取同一批鉤藤樣品2的藥材粉末共 6 份，精密稱定，按照“2.1.3”項(xiàng)下方法操作，得到供試品溶液，測(cè)定兒茶素、原花青素B2和表兒茶素的平均含量分別為0.018%、0.0041%和0.0085%；RSD分別為1.3%、0.7%、1.6%。

2.1.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取適量含量已知的鉤藤粉末9份，精密稱定，隨機(jī)分為3組，每組按照藥材含量80%、100%、120%的比例分別加入兒茶素、原花青素B2、表兒茶素對(duì)照品，加入甲醇補(bǔ)足至5 mL，按“2.1.3”項(xiàng)下制備供試品，測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，兒茶素、原花青素B2、表兒茶素的加樣回收率分別為 99.8%、100.7%、100.3%，RSD分別為2.7%、2.2%、3.0%。

2.2 校正因子重現(xiàn)性考察

2.2.1 色譜柱及高效液相色譜儀考察 試驗(yàn)考察了Waters 2695-2996、Agilent 1260兩種高效液相色譜系統(tǒng)，每種型號(hào)的儀器各一臺(tái),考察了Agilent Eclipse Plus C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Inertsil ODS(250 mm×4.6 mm，5 μm)兩種色譜柱。計(jì)算原花青素B2、表兒茶素對(duì)兒茶素的相對(duì)校正因子依次在0.600～0.724、0.694～0.769，其中不同儀器所得相對(duì)校正因子的RSD在1.2%～5.0%，同一儀器不同色譜柱所得相對(duì)校正因子的RSD在0.29%～4.9%。

2.2.2 待測(cè)組分色譜峰的定位 根據(jù)兒茶素的保留時(shí)間，計(jì)算原花青素B2和表兒茶素對(duì)于兒茶素的相對(duì)保留時(shí)間，可對(duì)其色譜峰進(jìn)行定位，考察相對(duì)保留時(shí)間在不同品牌儀器和不同規(guī)格色譜柱中的重現(xiàn)性，其中原花青素B2對(duì)兒茶素的相對(duì)保留時(shí)間在1.102～1.124,表兒茶素的相對(duì)保留時(shí)間在2.195～2.306，RSD分別為0.66%、2.1%。

2.2.3 一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法結(jié)果比較 精密吸取不同批次飲片供試品溶液各 5 μL 進(jìn)樣并測(cè)定。采用外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法分別計(jì)算鉤藤飲片中兒茶素、原花青素B2、表兒茶素的含量,結(jié)果見表2。

表2 外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)(QAMS)法測(cè)定鉤藤飲片中目標(biāo)成分含量(mg·mL-1)

比較兩種方法所得到的含量值,其中原花青素B2的相對(duì)誤差在0.8%～2.6%,表兒茶素的相對(duì)誤差在0%～5.0%，表明兩種含量測(cè)定方法得到的含量值之間無顯著性差異,一測(cè)多評(píng)法應(yīng)用于鉤藤飲片中3種成分的含量測(cè)定可行性較高。

3 討論

3.1 提取溶劑考察 本試驗(yàn)考察了甲醇、乙醇和水作為提取溶劑進(jìn)行提取,發(fā)現(xiàn)使用體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇對(duì)供試品進(jìn)行超聲提取，3種目標(biāo)成分提取率較高,分離度較好。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇 通過對(duì)兒茶素、原花青素B2和表兒茶素進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描發(fā)現(xiàn)，3種成分紫外吸收十分相似，均在 230 nm 處有最大吸收，在 270 nm 處有肩峰，故選取 230 nm 為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 檢測(cè)結(jié)論 從檢測(cè)結(jié)果來看，3種成分中兒茶素含量最高，其次是表兒茶素，原花青素B2含量最低；從產(chǎn)地來看，云南產(chǎn)鉤藤飲片中3種成分的含量較高。

3.4 一測(cè)多評(píng)方法建立的相關(guān)考察 本試驗(yàn)考察了常用不同廠家液相色譜儀器、不同類型色譜柱，結(jié)果表明，由于3種成分均為黃烷類成分，紫外吸收相近，相對(duì)校正因子的RSD值差異較小,因此利用一測(cè)多評(píng)的相對(duì)校正因子對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量控制是合理可靠的。含量測(cè)定結(jié)果表明不同產(chǎn)地的鉤藤飲片中3種黃烷類成分含量及比例差異較小，用QAMS計(jì)算值與外標(biāo)法實(shí)測(cè)值之間沒有顯著性差異，說明建立的校正因子具有較好的可信度。

4 結(jié)論

鉤藤中的生物堿類成分一直是該藥材中研究的熱點(diǎn)及主要的質(zhì)控目標(biāo)，但中藥的藥效往往是多成分多靶點(diǎn)共同作用的結(jié)果，因此關(guān)注除生物堿以外的多種活性成分也是中藥質(zhì)量控制的重要方向。本試驗(yàn)建立了鉤藤飲片3種成分的一測(cè)多評(píng)法，同時(shí)檢測(cè)兒茶素、原花青素B2和表兒茶素。原花青素B2類成分屬于縮合鞣質(zhì)類成分，高溫和光照易分解,穩(wěn)定性較差，因此該類成分的對(duì)照品制備有較高的難度和局限性，外標(biāo)法對(duì)該類成分的測(cè)定中往往因?qū)φ掌饭?yīng)等問題，實(shí)施難度較高。考慮到原花青素B2穩(wěn)定性差，純化難度高，對(duì)照品不易得等實(shí)際問題，而兒茶素對(duì)照品廉價(jià)易得且在鉤藤飲片中含量較高，因此本試驗(yàn)中選擇兒茶素為內(nèi)參，采用一測(cè)多評(píng)法可對(duì)鉤藤飲片中的縮合鞣質(zhì)以及其基本組成單元兒茶素和表兒茶素進(jìn)行同時(shí)測(cè)定。

本試驗(yàn)旨在建立較為方便且實(shí)用的一測(cè)多評(píng)的方法對(duì)鉤藤飲片的黃烷類成分進(jìn)行測(cè)定，在建立方法的過程中選用了最接近臨床和使用方便的藥房飲片，共選取了 3 個(gè)產(chǎn)地，通過本試驗(yàn)建立的方法希望可以在將來鉤藤藥材的全產(chǎn)業(yè)鏈的質(zhì)量控制和評(píng)估中發(fā)揮相應(yīng)作用。