構樹皮提取物軟膏的制備及含量測定

戴 晨，朱治文，陳 建，開偉華

(1.銅陵職業技術學院；2.安徽安科恒益藥業有限公司，安徽 銅陵 244000)

構樹別名彀、楮樹、沙低樹、谷漿樹等，為桑科(Moreceae)構樹屬，構樹[Broussonetiapapyrifera(L.) vent]的莖皮，性味甘平，具有祛風止癢、利水、祛風散熱，治風疹、風疹、目赤腫痛、小便不利之功效[1]。黃酮類成分是構樹皮的主要成分[1-2]。課題前期，課題組選用聚酰胺樹脂分離純化總黃酮化合物，并篩選構樹皮總黃酮的最優工藝，平皿藥基法研究結果表明，構樹皮提取液對紅色毛癬菌和絮狀表皮癬菌的抑菌效果顯著[3]。軟膏劑作為透皮給藥的一種劑型，主要起保護和潤滑皮膚、粘膜及局部治療的作用，軟膏中的藥物可通過透皮吸收達到治療目的。本實驗在提取工藝不變的基礎上，將構樹皮提取液作為水相進一步制成軟膏，并考察軟膏的外觀性狀、粒度、穩定性、總黃酮含量，為構樹皮軟膏的臨床應用提供參考。

1 儀器與試藥

電子分析天平(Shimadzu，AP225WD，0.1 mg)，旋轉蒸發儀(上海申生科技有限公司)，紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)，鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)，顯微鏡(BX53+DP27，日本OLYMPUS)

構樹皮采集于安徽銅陵(銅陵市食品藥品檢驗中心鑒定)，槲皮素對照品(100081-201610)(98%，Sigma Aldrich)，聚酰胺樹脂(60～100目，西亞試劑)，液狀石蠟、凡士林、硬脂酸、十二烷基硫酸鈉、單硬脂酸甘油酯、甘油均購自國藥集團化學試劑有限公司，水為純化水。

2 實驗方法與結果

2.1 提取液制備構樹皮粉末過3號篩，以70%乙醇超聲20 min，濾過，合并濾液，減壓濃縮配成60 mg/mL的構樹皮粗提物溶液，以1 BV/h流速上樣，充分吸附4 h，用蒸餾水洗至流出液為無色后，用60%乙醇以流速1 BV/h進行洗脫，重復洗脫3個周期，減壓回收至無醇味，濃縮至原藥材粉末濃度約2 g/mL，4 ℃冷藏備用[4]。

2.2 構樹皮提取物乳膏制備本試驗“2.1”項下提取液代替蒸餾水，同時也為軟膏主藥。根據文獻調研和預試驗結果，試驗中固定凡士林-硬脂酸-液體石蠟質量比例(1.2∶1∶1)共30 g，十二烷基硫酸鈉10 g、單硬脂酸甘油酯6 g、甘油15 g、羥苯乙酯0.1 g、提取液適量，處方總量100 g。油相：凡士林-硬脂酸-液體石蠟和單硬脂酸甘油酯；水相：提取液、甘油、十二烷基硫酸鈉、羥苯乙酯，分別置于蒸發皿中，水浴加熱至80 ℃，在等溫條件下將水相緩緩倒入油相中，以轉速200～300 r/min不斷攪拌20 min，使之充分乳化至冷凝，即得構樹皮提取物軟膏。

2.3 軟膏組方優化

2.3.1 綜合考察指標 以軟膏外觀均勻細膩性、涂抹延展性、離心穩定性、耐寒耐熱性作為成型性考察指標[5]，按照表1進行評分，具體如下：(1)外觀：取軟膏適量，目檢外觀是否色澤均勻、細膩，靜置是否發生自然分層，記錄結果并評分。(2)涂抹延展性：取軟膏適量涂抹于手背部觀察涂布是否有顆粒，記錄結果并評分。(3)離心穩定性：分別取各處方下的軟膏樣品1 g，置于離心管中，于4000 r/min的條件下離心30 min，觀察其外觀、分層及涂展性變化，記錄結果并評分。(4)耐寒性實驗：分別取各處方下的軟膏樣品1 g，置于離心管中，于-15 ℃條件下靜置24 h，觀察上述試驗樣品是否發生分層、變色等，記錄結果并評分。(5)耐熱性實驗：分別取各處方下的軟膏樣品1 g，置于離心管中，于55 ℃條件下靜置24 h，觀察上述試驗樣品是否發生分層、變色等，記錄結果并評分。對以上5項試驗的得分進行加和，作為最終評分結果。

表1 處方篩選各項指標考察評分表

2.3.2 響應面設計 在預試驗基礎上，根據響應面設計法的原理[6-8]，選擇對乳膏質量影響較為顯著的油相(凡士林-硬脂酸-液體石蠟)質量分數(X1)、乳化劑比(單硬脂酸甘油酯：十二烷基硫酸鈉)(X2)、甘油質量分數(X3)作為考察因素,采用Design-Expert試驗設計軟件，將以上3個因素作為優化的對象，考察其對綜合指標(Y)的影響。因素水平見表2，響應試驗方案及結果見表3。

表2 因素水平表

表3 中心組合試驗設計與結果

2.3.3 模型方程的建立及顯著性檢驗 利用Design Expert 8.0.6軟件，采用響應面分析法中的Box-Behnken Design建立數學模型，以綜合考察評分進行優化試驗設計，對表3所得數據進行二項式方程擬合，結果如下：

二項式擬合模型：

Y=96-1.87X1-0.75X2-0.88X3-X1X2-0.25X1X3-5.5X2X3-9.13X12-5.38X22-5.12X32

表4 響應模擬結果方差分析

2.3.4 效應面優化與預測 結合二項式擬合方程，利用Design-Expert 8.0.6軟件繪制因變量3D響應面圖及等高線，考察擬合的響應面曲線形狀，并通過響應面等高線圖和曲線圖對影響軟膏劑成型的條件中A、B、C三種因素交互作用效應進行評價和分析，從而確立X1、X2和X3，見圖1～3。由圖可知，軟膏成型隨X1、X3的增加先增大后減小，但隨X2的增加明顯具有增大效應，但影響不顯著；X2X3等高線的交互作用對軟膏成型影響最為顯著，而X1X2、X1X3等高線的交互作用對軟膏成型影響不顯著。本實驗對回歸方程進行預測，得到最大預測值96，X1=34，X2=7，X3=2。即凡士林-硬脂酸-液體石蠟用量為34%，單硬脂酸甘油酯：十二烷基硫酸鈉比為7，甘油用量2%。

圖1 X1X2對Y的效應面圖

圖2 X2X3對Y的效應面圖

圖3 X1X3對Y的效應面圖

2.3.5 工藝驗證 根據優選出的構樹皮提取物軟膏各稱取1 g，制備3份，將優化處方所對應X1、X2和X3代入回歸方程，求得Y預測值，按偏差%=(預測值-實測值)/預測值×100%，結果見表5。試驗表明，實測值與預測值相當，優化的參數準確可靠，軟膏組方科學合理可行。

表5 Y實測值與偏差

2.4 構樹皮提取物軟膏質量控制

2.4.1 性狀 本品為淡黃色的細膩膏狀半固體，氣微香、味微苦。

2.4.2 粒度 取供試品適量，置于載玻片上涂成薄層，薄層面積相當于蓋玻片面積，共涂3片，在顯微鏡下觀察，按照粒度和粒度分布測定法(通則0982第一法)進行測定[9]，見圖4。粒子最大直徑為12.48 μm，視野中均未發現大于180 μm的粒子，符合規定。

圖4 構樹皮提取軟膏粒徑顯微圖(×40)

2.4.3 穩定性離心試驗 取乳膏10 g裝入帶刻度的離心管中，以2500 r/min轉速離心30 min，乳膏無油水分層現象。

2.4.4 pH值的測定 取本品5 g，加水25 mL稀釋攪拌均勻后測定，得乳膏pH 6.8，RSD=2.3%(n=3)。

2.5 樹皮提取物軟膏總黃酮含量測定

2.5.1 對照品溶液配制 按照課題前期研究方法，取槲皮素對照品適量，加甲醇溶解定容，搖勻，制成0.1 mg/mL槲皮素對照品溶液備用[10]。

2.5.2 供試品溶液配制 取構樹皮提取物軟膏0.5 g，精密稱定，加甲醇溶解搖勻，配成10 mg/mL構樹皮提取物液[11]。

2.5.3 標準曲線繪制 精密量取槲皮素液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置10 mL具塞試管中，分別加1%三氯化鋁-甲醇液1 mL，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，放置15 min，以不加槲皮素標準液為空白，在270 nm波長下測定吸光度[12]。得出標準曲線A=0.027 C+0.0031，相關系數r=0.9996，說明槲皮素含量在0～50 μg/mL濃度范圍內具有良好的線性關系。

2.5.4 精密度試驗 精密量取槲皮素對照品貯備液(0.1 mg/mL)3.0 mL，按2.5.3項下方法測定，以不加槲皮素標準液為空白，在270 nm波長下測定吸光度，連續測定6次，結果吸光度相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)為1.74，表明儀器精密度良好。

2.5.5 重復性試驗 取供試品溶液1 mL，制備6份樣品，按2.5.3項下方法測定吸光度，RSD 1.65%。

2.5.6 穩定性試驗 取供試品溶液1 mL，制備6份樣品，分別于0、15、30、40、50、60 min按2.5.3項下方法測定，結果吸光度的RSD為1.73%，表明供液在1 h內基本穩定。

2.5.7 加樣回收率試驗 精密稱取構樹皮提取物軟膏0.25 g，平行樣品6份，分別精密加入槲皮素對照品適量，按照2.5.2和2.5.3項下方法處理，測定吸光度，計算平均回收率99.23%，RSD 1.82%。

2.5.8 總黃酮含量測定 取0.5 g構樹皮提取物軟膏3份，精密稱定，加甲醇溶解搖勻，配成10 mg/mL構樹皮提取物液，精密量取1.0 mL 1%三氯化鋁甲醇溶液1 mL，搖勻，放置顯色15 min后，由回歸方程求出3份軟膏中構樹皮提取物總黃酮含量，見表6。

表6 總黃酮含量測定

3 討論

3.1 制劑處方軟膏中乳劑型基質比油脂性基質易用于水除去，乳化劑可促進藥物與表皮接觸，本方選用乳劑型基質軟膏。乳劑型基質分為O/W型和W/O型，O/W型乳劑型基質油膩性低，能與水大量混合，藥物釋放和透皮吸收比較快[13]。因此本試驗選用O/W型乳膏，但O/W型基質含量水量多，在貯存過程中易干涸和霉變，方中加入保濕劑甘油和防腐劑羥苯乙酯。

3.2 試驗設計方法響應面優化法適用于解決非線性數據處理的相關問題，它考慮了試驗隨機誤差，在試驗條件尋優過程中，將復雜的未知函數關系在小區域內用簡單的一次或二次多項式模型來擬合，可以連續的對試驗各個水平進行分析，相比正交實驗只能對一個個孤立的實驗點進行分析，響應面優化法占有顯著優勢。因此本試驗選用響應面分析法優化構樹皮提取物軟膏的基質配比，在試驗設計范圍內，直接采用二次多項式非線性模型擬合與預測，效應面圖較好地描述影響因素與綜合指標的關系。

3.3 構樹皮前景展望構樹皮具有利濕祛痰、清熱涼血等功效，前期課題組發現構樹皮對紅色毛癬菌和絮狀表皮癬菌有強大抑制作用[4]，課題組提取構樹皮總黃酮活性成分，并將其進一步制成軟膏劑，該制劑具有制備工藝簡單可行，適合工業化生產等優點，該制劑的成果研制不僅可滿足局部淺部真菌感染患者的需求，而且具有廣闊的市場前景，為開發抗真菌新藥奠定基礎。