缺血性腦卒中患者外周血中miR-488分子標(biāo)志物實(shí)驗(yàn)研究

張欽政，李 琪，閆本純，馬潤瑤，馬思琦，任曉慶，閆海潤

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院；2.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院檢驗(yàn)科；3.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院泌尿外科，黑龍江 牡丹江 157011)

缺血性腦卒中(Ischemic stroke，IS)目前嚴(yán)重危害著人類健康，目前尚無可靠的IS生物標(biāo)志物。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)部分蛋白標(biāo)志物與IS的發(fā)生發(fā)展存在聯(lián)系，血清淀粉樣蛋白A(SAA)、缺血修飾蛋白(IMA)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)等蛋白可參與IS的生理病理過程[1]。但是，IS患者之間存在異質(zhì)性，因此上述蛋白標(biāo)志物作為IS的診斷標(biāo)志物仍需探討。近來有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，miR-128在IS患者外周血血清的表達(dá)水平明顯高于健康對(duì)照組，在IS發(fā)病后出現(xiàn)昏迷癥狀的患者外周血血清中miR-146a表達(dá)水平明顯低于健康對(duì)照組[2-3]。miR-488在其他疾病中具有調(diào)節(jié)功能，過表達(dá)的miR-488可抑制宮頸癌細(xì)胞的周期進(jìn)展，降低宮頸癌細(xì)胞的增殖和遷移能力[4]。miR-488在IS患者外周血中的表達(dá)水平變化少見報(bào)道，本研究旨在探討miR-488在IS患者血清中表達(dá)水平的變化，以及是否可作為IS的診斷指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 一般資料選擇2020年8月至2021年2月間于我院神經(jīng)內(nèi)科住院治療的IS患者60例作為病例組，根據(jù)發(fā)病時(shí)間分為：3 d病例組(30例)和7 d組病例(30例)，所有納入病例組患者均經(jīng)影像學(xué)確診為IS的患者；選擇同期來我院進(jìn)行常規(guī)體檢的健康體檢者30例作為對(duì)照組。

病例組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合2018年中國急性缺血性腦卒中診治指南[5]；(2)經(jīng)顱腦CT和(或)MRI檢查確診患者；(3)首次發(fā)病，既往無腦卒中病史。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)除IS以外的其他腦血管病；(2)肝、腎功能不全患者，心腦血管疾病患者，急性或慢性炎癥患者，癌癥或腫瘤患者；(3)近期存在外傷或行外科手術(shù)患者。查閱病歷和體檢者信息，記錄所有受試者年齡、性別、血壓、血糖、血脂、吸煙史等。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑 TRIpure Total RNA Extraction Reagent(ELK Biotechnology)；三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；EntiLinkTM1st Strand cDNA Synthesis Kit、EnTurboTMSYBR Green PCR SuperMix(ELK Biotechnology)；臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；冷凍離心機(jī)(湖南湘儀儀器)；制冰機(jī)(常熟市雪科電器有限公司)；PCR儀(杭州博日科技)；熒光定量PCR儀(Life technologies)；超凈工作臺(tái)(蘇凈安泰)。

1.2.2 收集血清樣本 于清晨采用普通生化管收集所有受測者空腹外周血5 mL，常溫下4000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上層血清至無菌無酶的離心管中，置于-80 ℃冰箱保存，備用。

1.2.3 血清miRNA的測定 解凍血清并取250 μL于無菌無酶管中，加入1 mL TRIpure，混勻，靜置5 min，加入250 μL三氯甲烷，充分混勻，冰上靜置5 min。將混合液4 ℃，10000 g，離心10 min。于超凈工作臺(tái)中小心吸取上清500 μL于1.5 mL EP管中，加入等體積4 ℃預(yù)冷的異丙醇，顛倒混勻，-20 ℃靜置15 min。將溶液4 ℃，10000 g，離心10 min，小心倒掉液體，加入1 mL 4 ℃預(yù)冷的75 %乙醇，顛倒數(shù)次，清洗RNA沉淀，4 ℃，10000 g，5 min離心，倒掉液體，于超凈工作臺(tái)中干燥數(shù)分鐘，將乙醇充分揮發(fā)干凈，加入100 μL RNase-Free Water，充分溶解RNA，根據(jù)ELK Biotechnology試劑盒步驟進(jìn)行miR-488表達(dá)量測定。PCR反應(yīng)閾值循環(huán)數(shù)(Ct)值通過StepOneTMReal-Time PCR儀獲得，以U6為內(nèi)參，采用2-△△CT計(jì)算各樣本miR-488的相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)反應(yīng)重復(fù)三次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用單因素方差分析LSD法進(jìn)行組間比較及兩兩比較，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。病例組和對(duì)照組所得血清miRNA結(jié)果以內(nèi)參U6校正，采用2-△△Ct計(jì)算miRNA相對(duì)表達(dá)量。P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ROC曲線用于miRNA在IS診斷價(jià)值中的優(yōu)劣。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料分析病例組與健康對(duì)照組在年齡、性別、糖尿病、吸煙、高血壓、高血脂等方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 兩組研究對(duì)象的基本資料

2.2 血清miR-488表達(dá)水平病例組血清miR-488相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組相對(duì)表達(dá)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。3 d病例組血清miR-488相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；7 d病例組血清miR-488相對(duì)表達(dá)量為分別高于對(duì)照組和3 d病例組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表2。

表2 各組血清中miR-488相對(duì)表達(dá)量

2.3 ROC曲線分析結(jié)果通過ROC曲線對(duì)miR-488作為IS診斷標(biāo)志物的效率進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果顯示，miR-488的AUC為0.839，敏感度和特異度分別為85%和70%，采用約登指數(shù)確定其截?cái)嘀禐?.175，見圖1。

圖1 IS患者血清miR-488的ROC曲線

3 討論

近年來研究發(fā)現(xiàn)，miRNA與多種疾病的發(fā)生發(fā)展和診斷方面存在聯(lián)系[6]，在IS的生理病理機(jī)制中扮演重要角色。在IS外周血中miRNA表達(dá)譜存在明顯變化，并與炎癥、細(xì)胞凋亡、預(yù)后和診斷等存在重要聯(lián)系[7-9]，因此部分學(xué)者認(rèn)為，miRNA甚至可能成為IS的治療新靶點(diǎn)[10]。miRNA分子可通過血腦屏障，腦組織miRNAs水平與血清miRNAs水平變化一致[11]，檢測血清中miRNAs表達(dá)水平可進(jìn)一步反應(yīng)IS時(shí)大腦中miRNAs的變化。IS是常見的卒中類型，本文所研究的病例組和對(duì)照組在高血壓、高血脂、糖尿病、吸煙等方面不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與先前的報(bào)道存在差異[12]，可能與本文所選擇的樣本含量較少有關(guān)。本研究重點(diǎn)在于探討miR-488對(duì)于IS的診斷價(jià)值，未將miR-488與IS的嚴(yán)重程度、患者預(yù)后及復(fù)發(fā)納入研究，在今后的研究中，將著重研究這些方面，對(duì)于IS的診斷、預(yù)測預(yù)后和復(fù)發(fā)具有重要價(jià)值。

IS發(fā)生后，不同時(shí)間段的miRNA表達(dá)譜存在差異，同一miRNA在不同時(shí)間段表達(dá)水平也存在差異。本文根據(jù)發(fā)病后時(shí)間分為3 d病例組和7 d病例組，與對(duì)照組相比，3 d病例組血清miR-488相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組(P<0.01)，7 d病例組血清中miR-488相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組和3 d病例組(P<0.01)。本文研究結(jié)果與Sepramaniam[13]研究所發(fā)現(xiàn)的miR-488在IS患者外周血中表達(dá)水平上升一致，并較之前的研究將病例組劃分更加精確。ROC曲線分析結(jié)果所示，外周血血清中miR-488對(duì)IS進(jìn)行診斷時(shí)，盡管敏感度(85%)、特異度(70%)相對(duì)不高，但仍具有一定的診斷價(jià)值。miRNA可以調(diào)節(jié)多種mRNA以實(shí)現(xiàn)基因調(diào)節(jié)功能，而現(xiàn)階段，國內(nèi)外學(xué)者并未對(duì)miR-488在IS發(fā)生發(fā)展過程的機(jī)制進(jìn)行深入研究，僅Zhou，L[14]等對(duì)miR-488-3p通過VPS4B蛋白可以IS的神經(jīng)細(xì)胞死亡進(jìn)行了研究，因此，在以后的研究中將深入探討miR-488所調(diào)節(jié)的靶基因及通路，以期為治療IS提供新思路。本文提到部分學(xué)者研究認(rèn)為蛋白標(biāo)志物或許可作為IS診斷的標(biāo)志物，但將miRNA與蛋白標(biāo)志物進(jìn)行聯(lián)合檢測的研究較少，若尋找miR-488所調(diào)節(jié)的蛋白標(biāo)志物，進(jìn)行聯(lián)合檢測或許對(duì)于IS的診斷價(jià)值更高。

綜上所述，本文研究表明，miR-488分子標(biāo)志物具有作為IS早期診斷標(biāo)志物的潛能。