FGFR3基因突變在膀胱癌中的診斷價值

李夢雨，富宏然，徐明鑫，于海嬌，李榮輝，金 紅

(牡丹江醫(yī)學院1.第一臨床醫(yī)學院；2.附屬紅旗醫(yī)院檢驗科，黑龍江 牡丹江 157011)

膀胱癌是全球發(fā)病第9位的惡性腫瘤，位居泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤榜首[1-2]。膀胱癌大多數組織學類型為尿路上皮癌，可分為非肌層浸潤性膀胱癌(Non-muscular invasive bladder cancer,NMIBC)或肌層浸潤性膀胱癌(Muscular invasive bladder cancer,MIBC)，復發(fā)率高，生存率低[3]。FGFR3基因的突變激活會導致一些常染色體顯性遺傳疾病和腫瘤的發(fā)生，人們試圖揭示FGFR3基因突變在膀胱癌發(fā)病機制中的作用。FGFR3基因p.R248C和p.S249C是膀胱癌中最常見的兩個突變位點，本研究采用dPCR技術，對膀胱癌患者和良性膀胱疾病患者的組織進行FGFR3基因突變的研究，旨在探討FGFR3基因兩個突變位點在膀胱癌中的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象

1.1.1 納入及排除標準 納入標準：(1)術前經過手術或超聲介導的細針穿刺病理檢查診斷為膀胱癌和良性膀胱疾病，術后病理符合膀胱癌和良性膀胱疾病診斷，其中膀胱癌患者病理確診均為移行細胞癌；(2)術前均未進行放化療和免疫治療；(3)石蠟切片中殘留的組織DNA含量滿足提取要求。排除標準：(1)由其他惡性腫瘤轉移的膀胱癌患者；(2)術前進行放化療和免疫治療的患者。

1.1.2 一般資料 收集2019年8月至2020年12月間牡丹江醫(yī)學院附屬紅旗醫(yī)院就診的40例膀胱癌和40例良性膀胱疾病患者的組織標本；膀胱癌組病例依據病理結果分為NMIBC組21例和MIBC組19例，男性31例，女性9例，年齡40～87歲，平均年齡(66.2±14.6)歲。根據國際抗癌協會的2017年第8版TNM分期法，Ta期15例，T1期10例，T2a期8例，T2b期3例，T3a期3例，T3b期1例。良性膀胱疾病組均為腺性膀胱炎，男性16例，女性24例，年齡43～86歲，平均年齡(65.4±15.3)歲。并且兩組人群性別、年齡分布無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，均為同時期和同地區(qū)收集，具有可比性。本研究嚴格按照赫爾辛基宣言，遵守醫(yī)學倫理委員會批準協議，所有納入研究的人員均自愿簽署知情同意書。臨床資料等數據資料來源于患者病例報告。

1.2 主要試劑與儀器TD-1數字PCR平臺(droplet digital PCR System)和人FGFR3基因融合和突變檢測試劑盒購于北京新羿生物公司，石蠟包埋組織基因組DNA提取試劑盒(FFPE Tissue Genomic DNA Kit)購于北京全式金生物技術有限公司。

1.3 檢測方法

1.3.1 組織標本采集與前處理 取組織標本，每標本刮取10張石蠟包埋組織切片(5 μm厚)置于1.5 mL離心管中，以二甲苯作為脫蠟劑，使用石蠟包埋組織基因組DNA提取試劑盒(北京全式金生物技術有限公司)提取組織DNA，儲存在-80 ℃冰箱。采用定量分析法檢測DNA濃度，直至提取DNA質量合格。

1.3.2 FGFR3基因突變位點的檢測 使用人FGFR3基因融合和突變檢測試劑盒和TD-1數字PCR平臺聯合檢測FGFR3基因突變位點。在試劑準備區(qū)根據空白對照(DEPC水)、陽性對照及待測樣本數量配制逆轉錄PCR擴增試劑預混液，組成30 μL反應體系：9 μL預混液A(DNA聚合酶、dNTP、UNG酶、UTP、氯化鎂和緩沖液)，3 μL預混液B(逆轉錄酶、RNA酶抑制劑)，3 μL檢測液(引物、探針)，3 μL陽性對照(FGFR3基因融合和突變陽性質粒DNA、陰性細胞系總RNA)和20 ng腫瘤DNA。參照北京新羿生物公司提供的說明書生成液滴，在4 ℃環(huán)境下1 h內進行一步法逆轉錄擴增反應：55 ℃逆轉錄15 min，95 ℃熱啟動10 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火延伸1 min，40個循環(huán)后，12 ℃儀器冷卻5 min。在生物芯片分析儀上檢測液滴，結束后進行數據分析。

1.4 統(tǒng)計學方法將本研究收集的樣本資料使用Spss 23.0軟件處理與分析數據。計量資料以“均數±標準差”表示。計數資料以相對數表示，組間差異采用卡方檢驗或Fisher確切概率法。繪制ROC曲線判斷FGFR3基因突變的診斷價值，AUC組間差異的比較使用z檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 膀胱癌組和良性膀胱疾病組中FGFR3基因突變比較FGFR3基因在膀胱癌組中，FGFR3位點p.S249C的突變率為50.00%(20/40)，位點p.R248C的突變率為27.50%(11/40)；在良性膀胱疾病組中，FGFR3位點p.S249C的突變率為10.00%(4/40)，位點p.R248C的突變率為0.00%(0/40)。FGFR3基因在膀胱癌中有很高突變率，膀胱癌組與良性膀胱疾病組相比較FGFR3基因突變率明顯升高，具有統(tǒng)計學意義(P<0.01),見表1。

表1 膀胱癌和良性膀胱疾病中FGFR3基因突變比較

2.2 膀胱癌組織FGFR3兩個突變位點的關聯性在40例膀胱癌組織標本中，總突變率為57.50%(23/40)，20例p.S249C位點突變樣本中有8例同時發(fā)生了p.R248C位點突變，即患者存在兩點突變，二者一致性為40.00%(8/20)；20例p.S249C突變陰性中，3例p.R248C突變，P>0.05；FGFR3兩個位點突變無關聯,見圖1、表2。

圖1 突變位點韋恩圖

表2 膀胱癌組織FGFR3兩個突變位點的關聯性

2.3 FGFR3基因突變與膀胱癌各臨床參數的關系FGFR3基因突變在不同年齡組中比較，差異有統(tǒng)計學意義，但單個點突變與年齡無關；在腫瘤大小方面比較，差異具有統(tǒng)計學意義；在腫瘤是否復發(fā)中比較，差異也有統(tǒng)計學意義，但p.S249C突變與復發(fā)無關；與MIBC相比，FGFR3突變在NMIBC中有很高檢出率，在不同的病理分級比較中有明顯統(tǒng)計學差異，FGFR3總突變的χ2=6.320，P=0.012,見表3。

表3 FGFR3基因突變與膀胱癌各臨床參數的關系

2.4 繪制FGFR3兩個突變位點診斷膀胱癌的ROC曲線通過繪制ROC曲線，計算出敏感性、特異性和曲線下面積AUC,見表4、圖2。

表4 兩個突變位點的敏感性和特異性(%)及AUC

圖2 FGFR3兩個突變位點的ROC曲線

3 討論

FGFR3基因在膀胱癌組中，FGFR3位點p.S249C的突變率為50.00%(20/40)，位點p.R248C的突變率為27.50%(11/40)；在良性膀胱疾病組中，FGFR3位點p.S249C的突變率為10.00%(4/40)，位點p.R248C的突變率為0.00%(0/40)。FGFR3基因在膀胱癌中有很高突變率，膀胱癌組與良性膀胱疾病組相比較FGFR3基因突變率明顯升高，具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)FGFR3又稱成纖維細胞生長因子受體3，是四個高度保守卻結構相關的酪氨酸激酶受體家族中的一員。它位于4p16.3號染色體上，由19個外顯子和18個內含子組成，以往在遺傳性侏儒癥中對FGFR3的研究證實不同的疾病表型在FGFR3上有其不同的基因突變位點，這些突變有規(guī)律性和好發(fā)性[4]。FGFR3基因突變、易位和重組、過表達都易導致FGFR3基因過度活躍，可導致多發(fā)性骨髓瘤、黑色素瘤和宮頸癌等惡性腫瘤發(fā)生[5-6]。目前，FGFR3在膀胱癌中的突變類型僅發(fā)現有點突變一種形式，即FGFR3基因序列中發(fā)生堿基替換，導致其翻譯表達的蛋白質分子中一種氨基酸被另一種氨基酸所替代，發(fā)生錯義突變。

在本研究中，FGFR3突變在不同年齡組中比較，差異有統(tǒng)計學意義；在腫瘤大小方面比較，差異具有統(tǒng)計學意義；在腫瘤是否復發(fā)中比較，差異也有統(tǒng)計學意義，P值均小于0.05。以上結果說明FGFR3突變與膀胱癌患者的年齡有關，腫瘤≥3D/cm的膀胱癌患者更易檢測出FGFR3突變，而與腫瘤分期無關，這與報道有差異[7]。與肌層浸潤性膀胱癌相比，FGFR3突變在非肌層浸潤性膀胱癌中有很高檢出率，FGFR3總突變的P值為0.012，與文獻報道相符[8-9]。不僅如此，FGFR3突變對腫瘤復發(fā)也有一定的影響，與膀胱癌的預后密切相關，因本研究時限較短，未對其做預后分析，但相關文獻報道稱含有FGFR3突變的低腫瘤異質性患者總生存期比所有患者的總生存期長(P=0.044)[10]，利用FGFR3基因監(jiān)測膀胱腫瘤復發(fā)的敏感性和特異性高達70%和87%[11]。在檢測FGFR3突變時，本研究采用了dPCR技術，與傳統(tǒng)定量PCR(qPCR)技術相比具有更加出色的靈敏度、特異性和精確性。膀胱癌組FGFR3位點p.S249C的突變率為50.00%(20/40)，位點p.R248C的突變率為27.50%(11/40)，總突變率為57.50%(23/40)。一項研究表明，膀胱癌中最常見的突變部位是S249C，約占突變總數的61%[12]，突變率與本研究的結果存在差異，分析原因為本研究樣本量較少，可以通過提高樣本量再做統(tǒng)計分析。本研究以膀胱癌組和良性膀胱疾病組為研究對象繪制FGFR3兩個位點突變的ROC曲線，得到兩者診斷膀胱癌的敏感性、特異性和AUC，結果顯示，p.S249C位點突變敏感性較高，為50.0%，AUC為0.700；p.R248C位點突變敏感性略低，但診斷特異性高達100.0%，AUC為0.638，同時檢測FGFR3兩個位點突變可提高診斷效能。

在精準醫(yī)療快速發(fā)展的今天，組織活檢臨床應用有限，需要更多研究定義腫瘤標志物[13]。國外利用液體活檢對癌癥進行基因突變的檢測，取得了一定的成果[14-15]。本研究為后續(xù)在液體活檢中檢測FGFR3基因突變打下一定的基礎。

綜上所述，FGFR3基因突變與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展密切相關，在非肌層浸潤性膀胱癌中易突變，其中p.S249C位點突變較高，未來有望應用于臨床中實現對膀胱癌的早期篩查。