姜黃素對ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化病變的影響及機制

陳林津，李 巖，肖韓艷

(牡丹江醫學院，黑龍江 牡丹江 157011)

動脈粥樣硬化(AS)是心腦血管疾病的最常見病因，是臨床研究重點。AS是一個復雜的過程，涉及多種細胞和分子。巨噬細胞極化是動脈粥樣硬化的重要病理生理環節。巨噬細胞極化是近年來動脈粥樣硬化治療研究的熱點，巨噬細胞通過細胞內外受體感受微環境中不同的極化信號，通過不同的信號轉導途徑調控基因表達，成為具有不同表型和功能的M1型和M2型巨噬細胞[1]。本研究從調節巨噬細胞極化方面探討姜黃素對AS的調控作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和分組4周齡SPF級雄性ApoE-/-小鼠12只(購于維通利華公司)。隨機分3組，每組4只。空白組：給予高脂飲食+等量1 %羧甲基纖維素鈉灌胃；高濃度姜黃素組：給予高脂飲食+姜黃素200 mg/(kg·d)灌胃；低濃度姜黃素組：給予高脂飲食+姜黃素30 mg/(kg·d)灌胃，1次/d，連續8周。

1.2 實驗材料和器材姜黃素(美國Sigama公司)；羧甲基纖維素鈉(湖南匯虹試劑有限公司)；高脂飼料(派克生物公司，由Reasearch Diet生產)；iNOS、Arg-1、NF-κB、IL-10、β-actin抗體(Sangon公司)；低溫離心機(Eppendorf公司5804R)；-80 ℃冰箱(Thermal公司)；PCR自動系列化分析儀(Bio-rad公司Thermal Cycler S1000)；Ttotal RNA Kit(Omega公司R6834-02)；Transcriotor first strand cDNA synthesis Kit(Roche公司04897030001)；實時熒光定量PCR儀(Applied Biosystems公司)；FastStart universal SYBR Green Master(Roche公司RC-4913914001)。

1.3 血脂檢測ApoE-/-小鼠灌胃8周，禁止飲食不禁水12 h后，腹腔注射7%水合氯醛麻醉，剪去腹部毛發，開腹從腹主動脈中取血，樣本室溫靜置1.5 h，4 ℃、4000 rpm/min離心10 min，吸取上層血清進行血脂檢測。

1.4 HE染色取小鼠主動脈，生理鹽水沖洗三遍，10 %甲醛溶液固定12 h，石蠟包埋，切片為5 μm厚度，進行HE染色，利用光學顯微鏡進行觀察并拍照記錄，進行圖片數據分析，計算校正斑塊面積(斑塊面積/血管橫截面積)%。

1.5 免疫熒光定量PCR(Rt-qpcr)利用Omega RNA提取試劑盒處理小鼠主動脈組織，根據RNA提取試劑盒里提供的說明書按要求步驟提取總RNA。以β-actin為內參基因，利用SYBR Green Master(Roche)進行檢測iNOS、Arg-1、IL-10、NF-κB的mRNA水平，所有數據均重復測三次，計算iNOS/Arg-1。基因引物序列如表1所示。

表1 各引物序列

目的基因使用相對定量法用2-△△Ct計算mRNA表達量。

1.6 統計學分析采用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析。計量資料以“均數±標準差”表示。各組間比較采用單因素方差分析及t檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 姜黃素對ApoE-/-小鼠血脂的影響與空白組相比，高濃度姜黃素組小鼠血清中TC、LDL-C的含量均降低(P<0.05)，而低濃度姜黃素組差異無統計學意義；高濃度姜黃素組與低濃度姜黃素組各指標水平均有差異，表明姜黃素對于血脂調控的作用在于降低了小鼠血清中TC與LDL-C的含量(P<0.05)，且有濃度依賴性，見表2。

表2 各組ApoE-/-小鼠血脂檢測結果

2.2 姜黃素對動脈粥樣硬化斑塊的影響40倍鏡下發現各組均有動脈粥樣硬化斑塊的出現(見圖1)；利用計算機軟件校正斑塊面積，結果顯示高濃度姜黃素組校正斑塊面積低于空白組，二者差異有統計學意義(P<0.05)，低濃度姜黃素組校正斑塊面積差異無統計學意義(見表3)。表明姜黃素濃度依賴的影響動脈粥樣硬化斑塊，減輕ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化病變。

圖1 各組ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊HE染色的結果(×40)

表3 各組主動脈弓校正斑塊面積百分比

2.3 姜黃素對ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊中巨噬細胞及炎癥因子的調控作用相比空白組，高濃度姜黃素下調NF-κB、iNOS基因表達(P<0.05)，上調Arg-1、IL-10基因表達(P<0.05)，低濃度姜黃素組以上因子差異無統計學意義。這表明，姜黃素可以減輕動脈粥樣硬化斑塊的炎癥反應，升高抑炎因子IL-10，使巨噬細胞向M2方向極化，減小M1/M2巨噬細胞比值，由此達到對動脈粥樣硬化的調控作用，且姜黃素對炎癥的抑制和對巨噬細胞的調控具有濃度依賴性，見表4。

表4 各組ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊中iNOS、Arg-1、IL-10、NF-κB相對基因表達量

3 討論

動脈粥樣硬化的發生，發展是復雜的過程。動脈粥樣硬化的發病機理尚不完全清楚[2]，炎癥反應和脂質沉積在動脈壁是目前較公認的動脈粥樣硬化的主要因素，并且動脈粥樣硬化疾病預后的關鍵是動脈粥樣硬化斑塊的穩定性[3]，炎癥反應中人體的各種免疫系統被激活，表達各種炎癥因子，造成血管內皮功能的損害以及影響平滑肌細胞的增值與遷移從而下降了動脈粥樣硬化斑塊的穩定性。并且黃躍平等作者研究發現[4]，ApoE-/-小鼠血管內存在的炎癥反應，可以使動脈粥樣硬化斑塊的不穩定性增加。進一步提示了炎癥對動脈粥樣硬化斑塊具有影響。特別是在冠狀動脈和頸動脈，狹窄的血管管腔里的動脈粥樣硬化斑塊的不穩定及破裂[5]導致冠狀動脈粥樣硬化型心臟病的臨床癥狀，嚴重可危及生命。

目前如何控制動脈粥樣硬化的發生及發展已經成為臨床研究的重點。中藥以其獨特的多位點多方面的作用引起國內外研究者的關注，其中多個臨床Ⅰ期試驗已證實，姜黃素安全并且耐受性好，有研究提示[6]姜黃素可以通過改善糖代謝，脂肪代謝，抑制炎癥反應，刺激抗氧化酶，清除氧自由基、抗細胞增殖、促進細胞凋亡和保護內皮細胞等途徑起到對動脈粥樣硬化的調控作用。在本實驗中，通過建立ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化模型，并通過HE染色切片觀察動脈粥樣硬化斑塊計算校正面積，進一步證實了姜黃素具有抗動脈粥樣硬化病變的作用。

已有研究表明[7]炎癥物質可以通過MAPK/NF-κB通路誘導炎癥反應參與AS病變全過程。本研究發現姜黃素可以使動脈粥樣硬化組織中NF-κB表達下降，提示姜黃素可能是通過MAPK/NF-κB通路對動脈粥樣硬化進程中炎癥反應進行調控，進而調控動脈粥樣硬化進展。

目前研究表明巨噬細胞的極化對動脈粥樣硬化形成、發展、消退具有影響[8]，動脈粥樣硬化病變部位炎癥環境誘導外周的單核細胞向斑塊內遷移，并由于微環境條件的不同，可以誘導巨噬細胞向M1/M2方向極化，從而導致M1/M2的比值也在變化[9]。Gjurich,BN等作者的一項實驗表明[10]，在ApoE-/-小鼠的主動脈中，伴隨著IL-10的降低動脈粥樣硬化程度也升高。另外白瑞娜等作者表明[11]，M2巨噬細胞可以分泌IL-10抗動脈粥樣硬化，并且IL-10也具有使M1巨噬細胞向M2方向的雙重作用。本實驗發現高濃度姜黃素能夠增加AS模型小鼠動脈粥樣硬化斑塊組織中IL-10的表達，并與M2巨噬細胞標志物Arg-1表達上調趨勢一致。提示姜黃素可以上調IL-10的表達使巨噬細胞向M2方向極化，且具有濃度依賴性。TLR4-MAPL/NF-κB通路參與巨噬細胞極化。已有研究發現[12]激活PI3K/Akt信號通路中的關鍵信號因子NF-κB，可導致巨噬細胞向M1極化、遷移，促進炎性細胞因子分泌。本實驗發現姜黃素下調轉錄因子NF-κB的表達，與M1巨噬細胞標志物iNOS表達下調趨勢一致，提示姜黃素通過下調PI3K/Akt/NF-κB信號通路減少巨噬細胞向M1型極化。故姜黃素能夠調控巨噬細胞極化，改變M1/M2的比值。其中M1型巨噬細胞能夠分泌iNOS加重動脈粥樣硬化組織的炎癥反應，導致動脈粥樣硬化斑塊進展，加重動脈粥樣硬化病變[13]。M2型巨噬細胞釋放TGF-β促進斑塊纖維組織形成，從而增強動脈粥樣硬化斑塊的穩定性，激活PPARγ信號通路來發揮更強的吞噬作用，并抑制炎癥反應[11，14]。本實驗發現姜黃素減少巨噬細胞向M1型巨噬細胞極化，增加向M2巨噬細胞極化，下調M1/M2的比值，使動脈粥硬化斑塊穩定性增加。

綜上所述，本實驗通過建立ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化模型應用姜黃素干預，發現姜黃素降低了AS模型小鼠血脂水平，減少了主動脈粥樣硬化斑塊面積，可能機制是通過MAPK/NF-κB通路抑制動脈粥樣硬化斑塊組織炎癥反應，上調IL-10的表達使巨噬細胞向M2方向極化，下調PI3K/Akt/NF-κB信號通路減少巨噬細胞向M1型極化，減小了M1/M2巨噬細胞比值，增加動脈粥樣硬化斑塊穩定性。