姜黃素及其類似物H8對LPS誘導的單核巨噬細胞中炎癥因子表達的影響

李 超，賈 茜，袁曉環，李 琳

(1.牡丹江醫學院附屬紅旗醫院；2.牡丹江醫學院，黑龍江 牡丹江 157011)

姜黃素(curcumin)是一種低分子量化合物，具有抗氧化、抗炎、調節免疫、抗腫瘤、抗微生物等多方面藥理作用[1-2]，并且它的毒性低，來源廣泛，已成為醫療界的研究熱點。但姜黃素在體內生物活性較低，代謝率高、生物利用率低，故在臨床中限制了它的應用[3]。本實驗前期通過姜黃素作為母體，去掉其β-二酮基團，設計出分子量更小、穩定性更高的姜黃素類似物H8[(2E,5E)-2,5-雙亞芐基環戊酮](以下簡稱H8)。本研究擬探討姜黃素及其類似物H8對炎癥因子IL-6及TNF-α的影響，為炎癥性疾病的治療和研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 小鼠單核巨噬細胞株(j774a.1細胞)購自上海酶研科技有限公司。

1.1.2 藥品與試劑 DMEM培養基、胎牛血清、青鏈霉素混合液、胰蛋白酶；CCK-8試劑盒(上海同仁化工DOJINDO)；逆轉錄試劑盒(上海優博公司)；Trizol試劑(北京博來公司)；PCR引物(ABI)；SYBR Green熒光染料(美國羅氏公司Roche)；LPS脂多糖(美國Sigma)；ELISA試劑盒(Mouse TNF-α ELISA kit、Mouse IL-6 ELISA kit 深圳欣博盛生物有限公司)；姜黃素(Sigma-Aldrich)；H8[(2E，5E)-2，5-雙亞芐基環戊酮](本實驗室合成)。

1.1.3 儀器 超凈工作臺(德國ESCO)；恒溫細胞培養箱(美國Thermo Fisher)、相差顯微鏡(日本Olympus公司)；低溫高速離心機(德國Eppendorf公司)；PCR儀(德國Eppendorf公司)；酶標儀(美國Bio-Rad公司)；分光光度計(美國Beckman公司)；高效液相色譜儀(美國 Aglient 1200)；熒光定量PCR儀(美國 ABI stepone)

1.2 方法

1.2.1 j774a.1細胞的培養 j774a.1單核巨噬細胞，為貼壁生長細胞，使用DMEM培養基培養[含10%胎牛血清及青霉素(100 U/mL)和鏈霉素(100 μg/mL)]，置37 ℃的恒溫細胞培養箱中培養。細胞貼壁后更換培養液，當匯合度達到70%～80%時進行細胞傳代。細胞傳代貼壁后呈圓型，生長一定時間或當密度較高時呈梭型。

1.2.2 CCK-8法檢測姜黃素及H8的細胞毒性 將j774a.1細胞以5000個/孔的數量接種于96孔板中，使用DMEM(含血清)完全培養基進行培育，待12 h細胞貼壁后經行換液。本實驗分為對照組、藥物處理組(濃度分別為1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L)，藥物作用24 h后，在96孔版中加入10 μL /孔的CCK-8試劑，孵育5 h，使用酶標儀測定OD值，檢測細胞存活率。重復本實驗3次。

1.2.3 LPS誘導j774a.1細胞建立炎癥細胞模型 用1 μg/mL的LPS作用于j774a.1細胞建立炎癥細胞模型，實驗分為6組：(1)對照組：使用PBS處理；(2)L組：1 μg/mL LPS處理；(3)LC1組：1 μg/mL LPS+10 μmol/L姜黃素；(4)LC2組：1 μg/mL LPS+20 μmol/L姜黃素；(5)LH1組：1 μg/mL LPS+10 μmol/L H8；(6)LH2組：1 μg/mL LPS+20 μmol/L H8。首先使用姜黃素或H8預處理細胞2 h，然后加入1 μg/mL LPS刺激22 h，分別收集培養基上清液和細胞進行ELISA和RT-qPCR檢測。

1.2.4 RT-qPCR檢測姜黃素及H8對炎癥相關基因表達的影響 收集經過1.2.3步驟處理的細胞提取RNA，采用RT-qPCR技術檢測各組細胞中炎癥相關基因IL-6、TNF-α mRNA表達。各引物的序列如下：Mouse TNF-α 正向引物 5’-GCCACCACGCTCTTCTGTCT-3’，反向引物 5’-GGTCTGGGCCATAGAACTGATG-3’；Mouse IL-6正向引物 5’-ATGAAGTTCCTCTCTGCAAGAGACT-3’，反向引物 5’-CACTAGGTTTGCCGAGTAGATCTC-3’；Mouse Rps16正向引物 5’-AAGTCTTCGGGAGGCAAGAAA-3’，反向引物 5’-TTGCCCAGAAGCAGAACAG-3’。以Rps16基因為管家基因，通過Livak法計算IL-6和TNF-α mRNA表達含量。TNF-α擴增條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s；58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共25個循環，最后72 ℃延伸10 min。IL-6擴增條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s；58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環，最后72 ℃延伸10 min。重復試驗3次。

1.2.5 酶聯免疫吸附實驗(ELISA) 按照1.2.3步驟處理的細胞，收集上清培養基于EP管中，1000 rmp離心5 min，將上清轉移至新的EP管中備用，從4 ℃冰箱取出ELISA試劑盒平衡至室溫，按試劑盒中說明書進行操作，每孔加入不同濃度的標準品或上清液(100 μL/孔)，反應終止后，用酶標儀測量其OD值，并計算出培養基中IL-6與TNF-α的含量，實驗重復3次。

1.3 統計學處理采用GraphPad Prism 5.0軟件進行統計學分析，數據以“均數±標準差”表示，使用One-way ANOVA對結果進行分析，以P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 姜黃素及H8的細胞毒性比較姜黃素在濃度40 μmol/L時可見明顯細胞存活率下降(P<0.001)，說明高濃度的姜黃素有一定的細胞毒性，其余濃度的藥物與對照組相比，差異無統計學意義。故本實驗采用低濃度姜黃素進行，見表1。

表1 不同濃度姜黃素及H8對細胞毒性檢測結果

2.2 姜黃素及H8對炎癥因子基因表達的影響與對照組相比，L組IL-6基因表達明顯增加(P<0.01)；與L組相比，LC1組和LC2組IL-6基因表達明顯降低(P<0.01)。與L組相比，LH1組、LH2組IL-6基因表達均顯著下降(P<0.01)。并且發現與LC2組比較，LH2組IL-6基因有更顯著的下降(P<0.01)。與對照組相比，L組TNF-α基因表達明顯增加(P<0.01)；與L組相比，LC1組和LC2組TNF-α基因表達均著降低(P<0.01)。與L組相比，LH1組、LH2組TNF-α基因表達均顯著下降(P<0.01)。并且與LC2組相比，LH2組TNF-α基因下降更明顯(P<0.001)。以上結果表明H8對IL-6、TNF-α基因表達具有顯著的抑制作用并且優于姜黃素，見表2。

表2 姜黃素和H8對LPS誘導的單核巨噬細胞TNF-α、IL-6基因表達的影響

2.3 姜黃素及其H8對炎癥因子蛋白表達的影響與對照組相比，L組培養基上清中IL-6含量顯增加(P<0.01)。與L組相比，LC1組、LC2組、LH1組、LH2組上清中IL-6表達均明顯降低(P<0.01)。與LC2組相比LH2組上清中IL-6含量更明顯降低(P<0.01)。與對照組相比，L組上清中TNF-α表達明顯增加(P<0.01)；與L組相比，LC1組和LC2組TNF-α基因表達均著降低(P<0.001)。與L組相比，LH1組、LH2組TNF-α基因表達均顯著下降(P<0.01)。并且與LC2組相比，LH2組TNF-α基因下降更明顯(P<0.05)。以上結果證明了H8對LPS誘導的炎癥模型IL-6、TNF-α蛋白表達具有顯著的抑制作用并優于姜黃素，見表3。

表3 姜黃素和H8對LPS誘導的單核巨噬細胞TNF-α、IL-6蛋白表達的影響

3 討論

炎癥是機體對外界生物刺激所產生的一種生理性的防御反應，研究表明炎癥的產生是許多慢性疾病如糖尿病、癌癥、心血管疾病、關節炎、肥胖、自身免疫疾病等慢性疾病發生發展的主要原因，它參與在多種疾病的發生發展過程中。當致炎因子侵入機體時，體內的細胞如單核細胞、巨噬細胞等被激活，這些細胞會釋放多種內源性的炎癥介質，如前列腺素、白三烯、一氧化氮、組胺等，這些炎癥介質會導致血管通透性增加，使炎癥細胞趨化，進而導致炎癥的發生[4]，所以尋找安全、有效的抗炎藥物是醫學界一直以來探尋的熱點問題。

姜黃素具有低分子量的優點，并且具有抗腫瘤[5]、抗氧化[6]、抗炎[7]、調節免疫等多種生物學活性，其中抗炎作用這一優點尤為突顯。但正是因為其在體內具有較低的生物活性、較高的代謝率[8]，較低的生物利用率[9]等原因使其結構中β二酮結構片段不穩定[10]。本實驗室前期通過化學合成方法將姜黃素中的β二酮結構去掉，設計出H8，通過HPLC檢測降解率發現姜黃素降解率大約是姜黃素類似物降解率的3倍，檢測結果說明H8具有更強的穩定性，為進一步研發應用奠定了基礎。

炎癥反應的發生由多方面因素引起，其中細菌中脂多糖(LPS)為最常見的致炎因子，它可以剌激體內單核巨噬細胞合成和釋放多種炎性介質如TNF-α、IL-6等，它們可以觸發瀑布式炎癥級聯反應，進一步激活炎癥細胞，誘導炎癥反應的發生[11]。GUIMAR 等通過實驗證明了姜黃素能夠抑制脂多糖誘導的小鼠腹腔巨噬細胞炎癥因子TNF-α和IL-6釋放并呈劑量依賴性[6]。本實驗以脂多糖(LPS)誘導小鼠單核巨噬細胞建立體外炎癥模型，探究不同濃度的姜黃素及H8對炎性細胞因子在蛋白和基因中對TNF-α、IL-6表達的影響，結果發現在基因表達中：L組IL-6、TNF-α基因表達明顯高于對照組。經過不同濃度姜黃素及H8干預后IL-6與TNF-α基因表達均降低，與LC2組相比LH2組降低更明顯，表明H8在抑制炎癥因子基因表達上優于姜黃素。炎癥因子蛋白表達與基因表達結果相似，L組IL-6、TNF-α蛋白表達均高于對照組。姜黃素與H8均能抑制炎癥相關蛋白表達，且與LC2組相比LH2組降低更明顯。實驗結果表明姜黃素及H8作用于炎癥細胞模型后無論是在基因上還是在蛋白的表達上都能明顯降低TNF-α和IL-6的表達，并且與相同濃度的姜黃素相比H8表現出更強的抗炎作用。

綜上所述，姜黃素類似物H8不僅具有良好的穩定性，而且可以有效抑制炎性因子表達，發揮較強的抗炎作用，與姜黃素相比，其具有結構穩定、安全性高，抗炎效果好等優點，更可以有效的抑制炎癥，可以更好指導臨床，為臨床提供新的用藥方案。