仙靈骨葆膠囊對(duì)大鼠肝損傷的作用及機(jī)制研究

丁海虎，倪 虹，王元元，陶 靜，馬善峰，陶明飛，孫思雨

(蚌埠醫(yī)學(xué)院1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)中心；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室；3.第二附屬醫(yī)院藥劑科，安徽 蚌埠 233030)

肝纖維化(HePaticfibrosis,HF)是各種致病因素長(zhǎng)期刺激肝組織后的損傷修復(fù)反應(yīng)，是慢性肝病發(fā)展為肝硬化的必經(jīng)階段和共同病理途徑[1]。肝損傷是肝纖維化的第一步，多種原因可導(dǎo)致HF的發(fā)生，如病毒性肝炎、酒精攝入、藥物等。仙靈骨葆口服制劑是由淫羊藿、補(bǔ)骨脂、續(xù)斷、丹參、知母、地黃六味中草藥組成的復(fù)方制劑，具有滋補(bǔ)肝腎、接骨續(xù)筋、強(qiáng)身健骨的功效。2017年國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局(CFDA)藥品不良反應(yīng)信息72期通報(bào)提示警惕仙靈骨葆口服制劑引起的肝損傷風(fēng)險(xiǎn)，不良反應(yīng)表現(xiàn)包括肝酶水平升高、膽紅素水平升高、肝細(xì)胞損害等[2]。該藥在臨床上用于骨質(zhì)疏松、骨折等長(zhǎng)期需要服用的代謝類疾病，其肝損傷作用的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)鮮有報(bào)道，本文擬初步探究仙靈骨葆在動(dòng)物體內(nèi)的肝損傷作用及可能的機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)理論支持。

1 材料和方法

1.1 藥品與試劑仙靈骨葆膠囊[國(guó)藥集團(tuán)同濟(jì)堂(貴州)制藥有限公司，批號(hào)：180807]；秋水仙堿片(云南植物藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20180603 )；基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)，超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)檢測(cè)試劑盒全部購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司(批號(hào)分別為：E30473、E34817、E30239、E34758、E35868)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)SD大鼠60只，購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(皖)2017-001號(hào)，雌雄不限，分籠飼養(yǎng)，體重(210±10)g。動(dòng)物自由進(jìn)食，任意飲水，12 h交替光照，恒溫22 ℃，相對(duì)濕度50%～75%環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后實(shí)驗(yàn)。

1.3 儀器電子分析天平(上海精科)；酶標(biāo)分析儀(Rayto RT-6100)；HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋(國(guó)華電器有限公司)；冷凍高速離心機(jī)(德國(guó)EPPendorf)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海新苗醫(yī)療器械)。

1.4 動(dòng)物分組、給藥與模型制備60只SD大鼠，按照體重采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為5組，每組12只，分籠飼養(yǎng)。將動(dòng)物分為：正常對(duì)照組、仙靈骨葆膠囊低、中、高組，[按“動(dòng)物與人體每公斤體重折算系數(shù)表”，成人與大鼠折算系數(shù)為6.25，計(jì)算人與大鼠的每日灌胃劑量設(shè)定低、中、高三個(gè)濃度，分別為成人的等效劑量的1倍、4倍和10倍[3]，即0.27 g/(kg·d)、1.08 g/(kg·d)、2.7 g/(kg·d)、秋水仙堿組0.1 mg/(kg·d)，各組灌胃量均為10 mL/kg。正常對(duì)照組給予相同體積生理鹽水，連續(xù)灌胃給藥2周，末次給藥后禁食(不禁水)16 h，20%氨基甲酸乙酯0.01～0.02 mL/g腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈采血收集血樣。

1.5 大鼠體質(zhì)量變化、一般情況及肝指數(shù)測(cè)定測(cè)定實(shí)驗(yàn)前后大鼠體質(zhì)量變化、一般情況等并記錄。待取血后分離并取出肝臟，預(yù)冷4 ℃生理鹽水清洗血漬，濾紙吸去水分后進(jìn)行稱重，計(jì)算肝指數(shù)。肝臟指數(shù)=[肝臟濕重(g) /大鼠體重(g)]× 100%[4]。

1.6 生化指標(biāo)檢測(cè)肝功能取血后靜置2 h，4 ℃冷凍高速離心機(jī)、3500 rpm離心10 min，取上層血清，酶標(biāo)分析儀檢測(cè)MMP-9、ALT，AST含量。稱取0.4 g肝臟組織，加4 mL預(yù)冷生理鹽水在冰上剪碎，后用組織勻漿器進(jìn)行研磨，制備10%肝勻漿以檢測(cè)MDA、SOD含量。MMP-9、ALT，AST、MDA，SOD含量的檢測(cè)分別按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.7 肝臟病理學(xué)檢查取肝臟左外側(cè)葉，放入4%的多聚甲醛溶液中固定，同一部位石蠟包埋、HE染色，光鏡下觀察肝臟組織病理變化并攝片。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)結(jié)果以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，若符合正態(tài)分布，采用單因素方差分析；組間兩兩比較，方差齊采用方差分析-LSD檢驗(yàn)，方差不齊用Games-Howell檢驗(yàn)；不滿足正態(tài)分布時(shí)選擇秩和檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠毛發(fā)、飲食等一般情況正常對(duì)照組大鼠毛色健康有光澤，性情溫和，行為活動(dòng)正常，精神狀態(tài)良好，大小便正常；仙靈骨葆組低、高劑量組大鼠毛色無(wú)明顯變化，中劑量組、秋水仙堿組大鼠出現(xiàn)豎毛粗糙，蜷縮不喜動(dòng)，飲食飲水減少，大便稀軟等現(xiàn)象。

2.2 各組大鼠體質(zhì)量、肝指數(shù)變化實(shí)驗(yàn)前各組動(dòng)物體質(zhì)量無(wú)顯著性差異，實(shí)驗(yàn)后仙靈骨葆各組體質(zhì)量與正常組相比雖均有下降，但無(wú)顯著差異，秋水仙堿組體質(zhì)量顯著下降(vs正常對(duì)照組P<0.01，vs仙靈骨葆組P<0.05)。用藥后仙靈骨葆低、中、高劑量組和秋水仙堿組肝臟指數(shù)與正常組相比，均有顯著下降(P<0.01)，見表1。

表1 仙靈骨葆膠囊對(duì)大鼠體質(zhì)量與肝臟指數(shù)的影響

2.3 各組大鼠血清基質(zhì)金屬蛋白酶9( MMP-9)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的變化仙靈骨葆各組、秋水仙堿組較正常組大鼠血清MMP-9均顯著下降(分別為P<0.01、P<0.05)；而大鼠血清中的AST、ALT含量與正常組相比，仙靈骨葆低、中、高劑量組均顯著升高(P<0.01)，秋水仙堿組亦升高明顯(AST：P<0.05、ALT：P<0.01)。大鼠血清三個(gè)指標(biāo)中，尤以仙靈骨葆中劑量組MMP-9含量降低及AST、ALT含量升高較為顯著；秋水仙堿組與仙靈骨葆組均有顯著差異(P<0.01或P<0.05)，但與正常組相比其表現(xiàn)出升高或者降低的水平較低，見表2。

表2 仙靈骨葆膠囊對(duì)大鼠血清基質(zhì)金屬蛋白酶9( MMP-9)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的影響

2.4 各組大鼠肝組織超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)的變化與正常對(duì)照相比，仙靈骨葆低、中、高劑量組肝組織SOD含量均顯著降低(P<0.01)。而肝組織MDA含量均顯著升高(P<0.01)，而尤以中劑量組含量變化較明顯。秋水仙堿組肝組織SOD含量與正常組相比無(wú)顯著性差異，而肝組織MDA含量與正常對(duì)照組、仙靈骨葆組相比均有顯著性差異(P<0.01)，見表3。

表3 仙靈骨葆膠囊對(duì)大鼠肝組織超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)的影響

2.5 各組大鼠肝臟組織病理學(xué)檢查結(jié)果正常大鼠肝細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞質(zhì)分布均勻，細(xì)胞核大而圓，核仁清晰，肝小葉結(jié)構(gòu)完整規(guī)則，肝索呈放射狀排列整齊。仙靈骨葆組大鼠肝細(xì)胞損傷與劑量成相關(guān)的表現(xiàn)出炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，水腫明顯，細(xì)胞邊界模糊并出現(xiàn)壞死，可見肝小葉結(jié)構(gòu)不規(guī)則，肝索排列紊亂。秋水仙堿組肝細(xì)胞變性壞死的損傷程度較輕，可見少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，見圖1。

圖1 各組大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)的變化(HE染色，×100)

3 討論

藥物進(jìn)入體內(nèi)經(jīng)消化、吸收、循環(huán)后將經(jīng)過肝臟代謝，肝臟成為藥源性損傷的主要靶器官之一。引起藥物性肝損傷的前三位藥物類別分別是中草藥、抗結(jié)核藥及抗微生物用藥，損傷類型又以肝細(xì)胞型居多，在我國(guó)其構(gòu)成比在整個(gè)藥物不良反應(yīng)中約占10%～20%[5]。仙靈骨葆膠囊是根據(jù)苗族民間驗(yàn)方研制而成，臨床上常用于骨質(zhì)疏松和骨質(zhì)疏松癥、骨折、骨關(guān)節(jié)炎、骨無(wú)菌性壞死等癥。國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局(CFDA)2017年發(fā)布藥品不良反應(yīng)信息通報(bào)，報(bào)道中收集了2004年1月1日至2016年7月21日的仙靈骨葆口服制劑不良反應(yīng)報(bào)告2665例，其中嚴(yán)重報(bào)告81例(3.1%)，在81例嚴(yán)重不良反應(yīng)報(bào)告中肝膽系統(tǒng)損害占比較高，表現(xiàn)出肝酶水平升高、膽紅素水平升高、肝細(xì)胞損害等癥狀。李珊[6]等報(bào)道了39例仙靈骨葆膠囊不良反應(yīng)/事件分析，結(jié)果顯示累及器官相對(duì)單一，主要表現(xiàn)為肝損傷(17例，43.59%)。秦子飛[7]等確認(rèn)了“仙靈骨葆”13 個(gè)吸收入血原型成分，結(jié)果提示淫羊藿、補(bǔ)骨脂、續(xù)斷和知母四味中藥內(nèi)的成分可能對(duì)該藥體內(nèi)發(fā)揮作用較大。仙靈骨葆膠囊所致肝損害，其制劑中的淫羊霍和補(bǔ)骨脂均被懷疑為具有肝毒性[8]，淫羊藿具有雄激素樣作用，可干擾肝細(xì)胞正常代謝引起肝內(nèi)毛細(xì)膽管的膽汁淤積而出現(xiàn)肝功能異常[9]。目前，臨床上治療心腦血管疾病和骨質(zhì)疏松等疾病都需長(zhǎng)期服藥，這勢(shì)必要求對(duì)藥物的安全性評(píng)價(jià)應(yīng)更加予以重視。

肝臟血清酶活性的升高或蛋白質(zhì)下降水平與肝實(shí)質(zhì)受損程度呈一定相關(guān)性[10]，結(jié)果顯示血中ALT、AST升高提示仙靈骨葆膠囊對(duì)肝細(xì)胞造成損傷后使細(xì)胞膜通透性增加，另SOD活性顯著下降、MDA含量顯著升高，其機(jī)制可能是和肝細(xì)胞受損后有氧氧化能力降低有關(guān)；SOD通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用消耗增大,也可導(dǎo)致SOD活性減低，而MDA水平升高提示肝細(xì)胞脂質(zhì)過氧化。HE染色結(jié)果顯示隨著仙靈骨葆劑量增大呈現(xiàn)出正程度相關(guān)的肝細(xì)胞損傷和單核細(xì)胞浸潤(rùn)等肝臟炎癥早期病變，提示仙靈骨葆引起肝細(xì)胞損傷可能是對(duì)機(jī)體免疫功能的影響造成。本文觀察到體質(zhì)量、組織形態(tài)學(xué)結(jié)果仙靈骨葆高劑量組較中劑量組肝損傷作用較明顯而生化指標(biāo)中劑量組變現(xiàn)出更大的毒性，推測(cè)其可能原因?yàn)橹袆┝拷M灌胃水溶液溶解度高表現(xiàn)出較優(yōu)的藥代動(dòng)力學(xué)，而高劑量組因其濃度高對(duì)肝細(xì)胞具有較高的線粒體損傷作用。

肝內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)過度沉積是肝纖維化的主要特征，在生理及病理狀態(tài)下降解主要由基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)完成。MMP-9屬于明膠酶B類，屬肝內(nèi)該家族之一，在正常肝臟，基質(zhì)金屬蛋白酶-9的表達(dá)較強(qiáng)[11]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示仙靈骨葆引起肝損傷后MMP-9活性降低而使得ECM的降解能力下降，可能對(duì)肝損傷后的肝纖維化進(jìn)程有一定的促進(jìn)作用。秋水仙堿在臨床上常用于治療痛風(fēng)和抗腫瘤，相關(guān)報(bào)道提示秋水仙堿具有抗炎和破壞微管蛋白的作用或極有可能也是抑制枯否細(xì)胞的分化起到抗肝纖維化作用[12-13]。而本文結(jié)果顯示與相關(guān)研究[14]與有所關(guān)聯(lián)，表現(xiàn)出對(duì)大鼠肝組織具有一定的損傷作用，其對(duì)在體動(dòng)物肝的作用還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，本文初步對(duì)仙靈骨葆膠囊制劑造成大鼠肝損傷進(jìn)行了研究，為臨床用藥提供基礎(chǔ)的理論支持，其肝損傷的機(jī)制有待在細(xì)胞、分子等水平做進(jìn)一步深究。