AIF核轉(zhuǎn)位在海藻糖抑制OGD誘導(dǎo)SH-SY5Y細胞死亡過程中的作用及機制

王本玄，尹昌浩

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院；2.黑龍江省缺血性卒中防治重點實驗室;3.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院，黑龍江 牡丹江 157011)

缺血性腦卒中是一種急性腦功能障礙，是全球發(fā)病率和死亡率高的主要原因[1]。目前，缺血性腦卒中的干預(yù)和臨床治療雖然得到了改善，但其不良預(yù)后并沒有得到有效逆轉(zhuǎn)[2-3]。AIF是能夠誘導(dǎo)非caspase依賴性細胞死亡的促凋亡蛋白。近年來發(fā)現(xiàn)在凋亡信號刺激下，核AIF通過誘導(dǎo)染色質(zhì)溶解和DNA斷裂最終導(dǎo)致細胞死亡。海藻糖是一種安全、穩(wěn)定的雙糖[4]，它可通過抑制缺氧引起的氧化應(yīng)激來挽救細胞死亡[5]。SH-SY5Y細胞是人類神經(jīng)母細胞瘤細胞，在形態(tài)、神經(jīng)化學(xué)和電生理方面具有與神經(jīng)元相似的特性。因此，本課題采用SH-SY5Y細胞氧糖剝奪模型進行研究AIF在氧糖剝奪誘導(dǎo)的細胞死亡中的調(diào)控作用及海藻糖的干預(yù)機制，為缺血性腦血管病的治療提供潛在的治療藥物。

1 材料與方法

1.1 試劑人神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞購自中國科學(xué)院上海細胞生物學(xué)研究所(中國)。海藻糖、N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)(sigma，美國)，無糖培養(yǎng)基(Gibco，美國)，ROS檢測試劑盒(碧云天，中國)，MTT試劑盒(碧云天，中國)，細胞缺氧培養(yǎng)裝置(Billups-rothenberg公司，美國)，抗AIF抗體(美國的CST公司)，抗β-actin抗體(美國的CST公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)和方法使用青霉素(100 U/mL)和鏈霉素(100 μg/mL)和含有10%胎牛血清的DMEM在細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)細胞，并將其置于37 °C和5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中，每周更換兩次培養(yǎng)基。

1.3 實驗分組及處理將對數(shù)期生長的細胞接種到96孔板中(5～6)×103/孔，次日待細胞貼壁后將細胞分為正常組：不需進行預(yù)處理；海藻糖組：海藻糖(0.5 mmol/L、5 mmol/L)處理24 h；NAC組：NAC(5 mmol/L)處理24 h；OGD組：細胞貼壁后更換無糖無血清培養(yǎng)基并缺氧24 h；OGD+海藻糖組：細胞貼壁后更換無糖無血清培養(yǎng)基，海藻糖預(yù)處理1 h后再缺氧24 h；OGD+NAC組：細胞貼壁后更換無糖無血清培養(yǎng)基，NAC預(yù)處理1 h后再缺氧24 h；按照試劑盒說明操作敲減AIF基因，將SH-SY5Y細胞分為空轉(zhuǎn)組、scrambled組(與AIF基因有相同序列，但無明顯同源性)、AIFsiRNA組、OGD空轉(zhuǎn)組、OGD scrambled組(與AIF基因有相同序列，但無明顯同源性)、OGD AIFsiRNA組。

1.4 MTT法檢測細胞生存率取上述制備的SH-SY5Y細胞，每組設(shè)置6個復(fù)孔，按照實驗要求到作用時間后，棄上清，每孔加入20 μL的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)基加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，搖勻后于酶標儀下檢測490 nm處吸光度值，細胞生存率%=樣品組吸光度/對照組吸光度×100%。

1.5 熒光顯微鏡檢測ROS表達情況按照試劑盒使用說明，將制備好的DCFH-DA熒光探針溶液(1∶1000稀釋)加到OGD組的SH-SY5Y細胞中，并在避光條件下于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中孵育20 min，后置于熒光顯微鏡下觀察OGD組ROS表達情況。

1.6 siRNA敲減AIF細胞轉(zhuǎn)染(依據(jù)siRNA試劑說明書)按照一定比例配置轉(zhuǎn)染復(fù)合物，空轉(zhuǎn)組的配比為opt-MEM 10 μL、lipo3000 0.1 μL、DEPC水1 μL；scrambled組的配比為opt-MEM 10 μL、lipo3000 0.1 μL、NC1 μL；AIF siRNA組的配比為opt-MEM 10 μL、lipo3000 0.1 μL、siRNA 1 μL。上述三組份混合后室溫孵育10～15 min。從細胞培養(yǎng)箱取出細胞，用基本培養(yǎng)基(無血清無雙抗的DMEM培養(yǎng)基)沖洗2遍，按實驗分組加入轉(zhuǎn)染復(fù)合物，繼續(xù)孵育48 h。結(jié)束后，PBS緩沖液沖洗2次，OGD作用24 h根據(jù)實驗要求進行MTT檢測以及westernblot蛋白印跡分析。

1.7 氧糖剝奪實驗?zāi)Ｐ蛯?shù)期生長的細胞6×103接種到96孔板中，于次日對已貼壁的細胞更換無糖、無血清培養(yǎng)基，然后，放入缺氧培養(yǎng)裝置中并充入已混合好的5% CO2和95% N2組成的混合氣體，并置于37 ℃的恒溫孵箱中24 h。

1.8 western blot檢測線粒體、細胞質(zhì)和細胞核AIF蛋白表達情況收集SH-SY5Y細胞，提取相關(guān)蛋白，根據(jù)實驗操作要求進行western blot檢測，進行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵一抗、二抗、顯影等操作[6]，進行AIF蛋白表達檢測。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析使用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對每個測試數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，并使用Graphpad Prism 6.0軟件進行繪圖。計量資料表示為“均數(shù)±標準差”，組間比較通過t檢驗分析；以P<0.05表明差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OGD抑制SH-SY5Y細胞的增殖活力且增加細胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平MTT檢測結(jié)果顯示，隨著OGD作用時間的延長，SH-SY5Y細胞生存率降低(表1)。免疫熒光檢測結(jié)果顯示，ROS熒光強度隨著OGD作用時間的延長逐漸增強(圖1)。ROS試劑盒檢測結(jié)果顯示，OGD組ROS產(chǎn)生增加(表2)。

表1 OGD作用下SH-SY5Y細胞生存率變化

圖1 SH-SY5Y細胞ROS熒光強度變化

表2 OGD作用下SH-SY5Y細胞ROS表達變化

2.2 OGD可引起SH-SY5Y細胞發(fā)生AIF的核轉(zhuǎn)位western blot電泳圖灰度分析結(jié)果顯示，OGD組細胞中，細胞質(zhì)、細胞核AIF蛋白均表達上調(diào)，線粒體中AIF蛋白表達下調(diào)(表3)。

表3 各組細胞質(zhì)、細胞核、線粒體內(nèi)AIF蛋白表達情況

2.3 siRNA敲減AIF可提高OGD作用條件下的SH-SY5Y細胞生存率轉(zhuǎn)染siRNA敲減AIF，MTT檢測結(jié)果顯示，敲減AIF可提高OGD條件下的SH-SY5Y細胞生存率(圖2)。

圖2 siRNA敲減AIF后，SH-SY5Y細胞生存率變化

2.4 western blot蛋白分析siRNA敲減AIF后各組細胞內(nèi)AIF變化轉(zhuǎn)染siRNA敲減AIF顯示，逆轉(zhuǎn)了AIF在OGD AIFsiRNA組和OGD scrambled組中的蛋白表達(表4)。

表4 各組細胞細胞質(zhì)、細胞核、線粒體的AIF蛋白表達情況

2.5 海藻糖可逆轉(zhuǎn)OGD引起的SH-SY5Y細胞生存率降低及ROS的增加海藻糖、抗氧化劑NAC預(yù)處理均可提高OGD作用條件下的細胞生存率(圖3A)。海藻糖預(yù)處理抑制OGD引起的SH-SY5Y細胞內(nèi)ROS水平升高(圖3B)。

圖3 不同藥物預(yù)處理后細胞生存率及ROS變化

2.6 AIF蛋白在各組細胞中的表達情況western blot蛋白灰度分析顯示，海藻糖、NAC預(yù)處理逆轉(zhuǎn)了OGD誘導(dǎo)的AIF在細胞質(zhì)、細胞核、線粒體中的蛋白表達(表5)。

表5 western blot電泳圖蛋白灰度分析各組細胞細胞質(zhì)、細胞核、線粒體內(nèi)AIF蛋白表達變化

3 討論

正常細胞中，ROS以可調(diào)節(jié)的方式產(chǎn)生并作為重要的信號分子參與到細胞分裂、自噬過程和應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控[7]。有文獻報道，ROS及激活的氧化應(yīng)激反應(yīng)在腦缺血疾病的發(fā)展過程中起重要作用[8]。我們研究發(fā)現(xiàn)，OGD導(dǎo)致SH-SY5Y細胞氧化應(yīng)激水平升高，引起細胞死亡，這與之前的文獻報道相一致。因此，降低腦缺血狀態(tài)下的氧化應(yīng)激水平可能對腦缺血損傷具有保護作用[9]。本研究用抗氧化劑NAC預(yù)處理明顯緩解了OGD誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞死亡，因此，抑制細胞氧化應(yīng)激水平可降低OGD誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞死亡率。腦缺血狀態(tài)破壞了細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，導(dǎo)致細胞內(nèi)ROS積累，ROS一方面可以通過引起核酸的氧化損傷導(dǎo)致DNA鏈斷裂[10]；另一方面，造成線粒體損傷誘導(dǎo)AIF轉(zhuǎn)位入核，最終導(dǎo)致細胞死亡[3]。以上研究結(jié)果在SH-SY5Y細胞系中同樣得到了驗證，我們推測其機制可能是OGD引起SH-SY5Y細胞內(nèi)ROS積累，此時，ROS會作用于線粒體引起線粒體膜電位降低，導(dǎo)致位于膜間隙的AIF轉(zhuǎn)位入核引起細胞染色質(zhì)聚集導(dǎo)致細胞死亡。因此，我們認為OGD作用條件下SH-SY5Y細胞死亡的重要原因可能是氧化應(yīng)激水平升高導(dǎo)致ROS產(chǎn)生過多最終觸發(fā)AIF核轉(zhuǎn)位。

海藻糖作為一種安全可靠的天然糖類，當(dāng)細胞受到外界環(huán)境壓力時，它可通過減輕氧化應(yīng)激水平來抑制細胞死亡[11]。在OGD的作用條件下，線粒體損傷是神經(jīng)細胞死亡的重要原因。在本研究中，海藻糖可以抑制OGD誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞死亡，降低ROS的生成，同時還可以阻止AIF由線粒體向細胞核的轉(zhuǎn)位。因此，我們推測其機制可能是海藻糖通過降低SH-SY5Y細胞內(nèi)ROS的積累來減少其對線粒體的功能損傷，進而抑制AIF核轉(zhuǎn)位引起的細胞死亡。盡管目前抑制腦梗死氧化應(yīng)激水平的臨床試驗并不令人滿意[12]，但是探索其它抗氧化劑對缺血性腦卒中的可能作用仍是該領(lǐng)域的主要研究方向之一。

總之，我們的研究表明海藻糖通過緩解OGD誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞氧化應(yīng)激水平升高來抑制AIF核轉(zhuǎn)位，從而挽救細胞死亡。因此，深入研究AIF在OGD誘導(dǎo)的細胞死亡中的相關(guān)機制是非常重要的，可能為臨床減輕缺血性腦損傷提供新的研究方向。