LncRNA HAND2-AS1檢測對腫瘤診斷價值的Meta分析

胡尚尚，王媛媛，高 宇，3

(蚌埠醫學院 1.檢驗學院；2.生命科學院；3.癌癥轉化醫學安徽省重點實驗室，安徽 蚌埠 233030)

國際癌癥研究機構(International Agency for Research on Cancer，IARC)調查顯示，2018年全球估計有1810萬例新增腫瘤病例和960萬死亡病例[1-2]。因惡性腫瘤的早期篩查沒有普遍開展，故當發現患有惡性腫瘤時，大多數病人已處于晚期，且惡性腫瘤的病人普遍預后很差。因此開展腫瘤診斷標志物的篩選與鑒別對腫瘤患者的早期診斷十分重要[3]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一組大于200個堿基對的非編碼RNA，在發育、遺傳、干細胞生物學、癌癥等方面已成為多種生物學過程的重要分子。LncRNA HAND2反義RNA 1(HAND2-AS1)在不同類型的癌癥中表現出腫瘤抑制活性，如在結直腸癌中，HAND2-AS1可通過上調miR-1275介導的Kruppel樣因子14(Kruppel like factor 14，KLF14)表達來抑制結直腸癌的進展[4]；在非小細胞肺癌中，HAND2-AS1可通過與TGF-β1的相互作用抑制細胞遷移和侵襲[5]。本文以血液中HAND2-AS1的表達水平在多種癌癥中的臨床診斷價值做一Meta分析，探索HAND2-AS1檢測在多種腫瘤診斷方面的臨床意義。

1 資料和方法

1.1 納入和排除文獻的標準納入標準：(1)腫瘤患者必須經組織病理學檢查確診；(2)HAND2-AS1表達水平與腫瘤、癌癥的發生發展的相關性研究；(3)研究設計必須為病例對照研究；(4)研究必須提供足夠的資料以評估HAND2-AS1在腫瘤患者中的診斷價值；(5)全文以英文發表。排除標準：(1)會議、摘要、信件、綜述、社論和病例報告；(2)重復出版物；(3)只進行細胞或動物實驗；(4)研究的疾病不是關于腫瘤或者癌癥方面的。

1.2 文獻檢索策略以“HAND2-AS1 and cancer”或“HAND2-AS1 and tumor”或“HAND2 antisense RNA 1 and cancer”或“HAND2 antisense RNA 1 and tumor”為關鍵詞，在PubMed、Embase、SinoMed、CNKI和萬方等數據庫，檢索時限為1980年1月1日至2020年9月30日，國內外公開發表有關HAND2-AS1表達水平與腫瘤癌癥相關的所有文獻。

1.3 數據提取兩名評價員(胡尚尚，王媛媛)嚴格按照文獻納入與排除標準，獨立對檢索到的文獻進行評估和篩選；如遇到分歧，則所有作者共同閱讀該文獻，進行納入與否的判斷。同時，作者還檢查了所有相關文獻的參考目錄的文獻，以避免因為檢索詞或者數據庫收納的原因造成的文獻缺失。文獻選定后，需提取以下數據：腫瘤/癌癥類型、研究國別、實驗組和對照組的例數、HAND2-AS1的檢測方法及表達情況、文獻發表時間、作者信息等。

1.4 文獻質量評價根據診斷準確性研究的質量評價工具(Quality Assessment of Diagnostic Accuracy Studies，QUADAS)量表對納入文獻的質量進行評價，共參考11個條目，分為“是”、“否”、“不清楚”三個等級，回答“是”的加1分，回答“否”的減一分，回答“不清楚”的不加分。最后累計的分數為評判納入文獻的質量高低。0～6分為低質量文獻，6～11分為高質量文獻。

1.5 統計學分析采用STATA 14.0軟件對數據進行Meta分析。采用I2檢驗和Cochrane’sQ檢驗分析研究間的異質性，如果P≤0.1及I2>50%，表明存在的異質性，可采用隨機效應模型進行分析，反之，當P>0.1及I2<50%時，可采用固定效應模型或隨機效應模型進行分析[6]。綜合分析研究結果，對于診斷型Meta分析計算靈敏度(Sensitivity，SEN)、特異性(Specificity，SPE)、陽性似然比(Positive Likelihood Ratio，PLR)、陰性似然比(Negative Likelihood Ratio，NLR)和診斷比(Diagnostic Odds Ratio，DOR)。PLR值[敏感性/(1-特異性)]越大，真陽性的可能性越高，相反，NLR值(1-敏感度/特異度)越小，表示試驗結果真陰性的可能性越高。DOR是疾病中陽性的幾率與未患病的陽性幾率的比值，DOR的值范圍從0到無窮大，值越高表示區分測試性能越好。此外，還繪制了SROC，并采用Deek漏斗圖對納入的研究進行發表偏倚檢驗。另外采用費根圖計算診斷后概率。對于連續型變量合并效應量為標準化均數差(Standardized Mean Difference，SMD)，采用Cohen分類評價總體效應大小，SMD<0.2，屬于小效應；SMD在0.2～0.8之間，屬于中等效應；SMD>0.8屬于大效應[7]。并采用Begg’s檢驗，進行文獻發表偏倚檢驗。

2 結果

2.1 文獻檢索流程及結果如圖1所示，從PubMed、Embase、SinoMed、CNKI和萬方等數據庫檢索到153篇文獻，排除重復文獻111篇，剩余文獻42篇。通過對42篇文章進行題目和摘要分析后，排除以細胞或動物為實驗對象研究的文獻30篇，確定需要閱讀全文的文獻12篇。通過納入和排除標準，最終6篇文獻納入此Meta分析研究中。具體的文獻排除與納入的流程見圖1。

圖1 文獻納入與排除流程

2.2 納入文獻的基本信息經過嚴格的納入與排除標準，本研究共篩選出6篇相關文獻，且均為英文文獻。通過QUADAS評分，所有納入的文獻評分均符合納入與排除標準。這6個研究涉及到6種不同類型的腫瘤或癌癥，包括非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)[5]、宮頸鱗狀細胞癌(cervical squamous cell carcinoma，CSCC)[8]、骨肉瘤(osteosarcoma)[9]、三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)[10]、食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous‐cell carcinoma，ESCC)[11]、肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)[12]。累計317名腫瘤患者和227名健康對照者，采用RT-qPCR方法檢測血液中HAND2-AS1的表達情況，見表1。

表1 納入文獻的基本信息(n)

2.3 異質性檢驗及偏倚檢驗

2.3.1 定量分析 對于連續型變量采用異質性檢驗，結果為I2=38.1%，P=0.152(圖2)。該結果表明這些研究之間不存在異質性，因而選用固定效應模型對效應指標值進行合并。Begg's檢驗的結果為Z=1.5、P=0.153，表明無發表偏倚，倒置漏斗圖如圖3所示，經總體效應檢驗[SMD=-1.61，95%CI(-1.80，-1.41)，P<0.00001]，差異具有統計學意義。

圖2 HAND2-AS1定量分析森林圖

圖3 HAND2-AS1定量分析倒置漏斗圖

2.3.2 HAND2-AS1的診斷價值 如森林圖所示(圖4)，結果提示有顯著的異質性(SEN：I2=91.13，SPE：I2=80.58)，因此選擇隨機效應模型對納入對象的SEN、SPE、PLR、NLP、DOR合并分析。如圖5 Deek漏斗圖所示(t=-0.81，P=0.461)，未顯示出發表偏倚。獲得檢測血液樣品中HAND2-AS1的表達水平對多種腫瘤診斷價值的相關結果，SEN=0.87[95%CI(0.71，0.95)]，SPE=0.82[95%CI(0.71，0.90)]，PLR=4.9[95%CI(3.2，7.7)]，NLR=0.15[95%CI(0.07，0.35)]，DOR=32[95%CI(16，23)]。如圖6所示，SROC曲線[AUC=0.91，95%CI(0.88，0.93)]，AUC面積最大值為1，面積越接近1提示檢測對象的診斷價值越高。費根圖對HAND2-AS1圖分析顯示(圖7)，陽性結果的post-test概率從20%增加到55%，陰性結果減少到4%。

圖4 HAND2-AS1對多種腫瘤診斷的SEN和SPE森林圖

圖5 Deek漏斗圖

圖6 綜合受試者工作特征曲線

圖7 HAND2-AS1對多種腫瘤診斷的費根圖

3 討論

腫瘤是威脅人類健康的常見疾病，早期診斷對腫瘤治療至關重要[13]。近年來，對lncRNA的深入研究表明，lncRNA的表達水平在腫瘤細胞中被上調或下調，在腫瘤中充當癌基因或抑癌基因，lncRNA與腫瘤之間的關系已成為研究的熱點[14-15]。多個研究表明lncRNAHAND2-AS1具有抑制腫瘤發生發展的作用，并在多種類型的腫瘤中表達降低。在Li等人的報道中，宮頸癌患者與正常人相比，宮頸癌患者lncRNA HAND2-AS1表達降低，并且其可通過下調Rho相關蛋白激酶1抑制癌細胞的增殖、遷移和侵襲[8]。Min等人的研究中，三陰性乳腺癌患者與健康對照組相比，TNBC患者的lncRNAHAND2-AS1血漿水平顯著降低并能通過下調RUNX家族轉錄因子2抑制癌細胞的增殖而成為TNBC中的抑癌基因[10]。這些研究表明lncRNAHAND2-AS1作為抑癌基因在多種類型的腫瘤中起到抑制腫瘤發生發展的作用。綜上，lncRNAHAND2-AS1可作為多種腫瘤的潛在治療靶點和診斷標志物。

本次Meta分析中，通過定量評價和診斷分析，評估血液中HAND2-AS1對多種腫瘤的診斷價值。上述連續型變量分析中，合并效應量SMD=-1.61，95%CI(-1.80，-1.41)，通過分析森林圖，我們發現其95%CI橫線不與無效豎線相交，且該橫線落在無效線左側，說明血液HAND2-AS1表達水平與腫瘤的發生率存在負相關，提示血液HAND2-AS1表達降低與患癌癥的風險增加存在顯著的效應。隨后我們繼續對血液中HAND2-AS1的表達進行診斷分析，敏感度和特異度分別為87%和82%，在診斷多種癌癥中具有較高的準確性。此外PLR=4.9、NLR=0.15，表明HAND2-AS1對腫瘤診斷為陽性的可能性是錯誤診斷為陽性的可能性的4.9和對腫瘤錯誤診斷為陰性的可能性是正確診斷為陰性可能性的0.15倍。重要的是DOR=32和繪制的SROC曲線AUC=0.91，表明HAND2-AS1對區分腫瘤有很高的準確率；另外，費根圖圖顯示，HAND2-AS1可使腫瘤診斷準確率提高35%，從上述結果可以看出，血液中HAND2-AS1的表達對多種腫瘤的診斷有很高的準確性。

綜上所述，血液中HAND2-AS1的表達可作為多種腫瘤診斷的潛在標志物。但本次研究也存在一定局限性，首先在診斷分析中有顯著的異質性。異質性是影響此次研究的主要因素，我們通過嚴格的納入和排除篩選，也無法降低異質性。異質性的來源有很多方面，如研究的樣本來自不同的總體、研究的樣本量過少、研究實施的環境差異等，均是產生異質性的主要來源。其次本次研究對象只有中國人，這意味著我們的結果只適用于中國人，而且一些用于惡性腫瘤預測和診斷模型還未建立完善，相應的分子機制仍有待充分闡明。

總之，異常的lncRNA表達譜可作為一種新的生物標志物來區分腫瘤患者和健康個體，當前研究的數據有助于了解血液中HAND2-AS1的表達在多種腫瘤診斷中的價值。