丁苯酞對(duì)帕金森細(xì)胞模型的保護(hù)作用

周 倩，郭寶娟，王 慧，梁 軍，白雨鑫，楊曉帆，陳 培

(牡丹江醫(yī)學(xué)院1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織與胚胎學(xué)教研室；3.第一臨床醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室；4.附屬紅旗醫(yī)院康復(fù)科，黑龍江 牡丹江 157011)

帕金森病(Parkinson disease,PD)是臨床上最常見(jiàn)的神經(jīng)變性疾病之一，病理特征表現(xiàn)為中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的缺失和α-突觸核蛋白的聚集[1]。目前臨床上常規(guī)使用的多巴胺替代療法只能緩解部分臨床癥狀，無(wú)法減緩多巴胺能神經(jīng)退行性變的進(jìn)展。抗氧化治療在一定程度上為帕金森的治療開(kāi)辟了新的方向。丁苯酞由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院自主研制從芹屬種子中提取分離出來(lái)的化合物，目前用于缺血性腦卒中的治療。許多新的研究成果發(fā)現(xiàn)丁苯酞帕金森病也發(fā)揮了重要的保護(hù)作用[2]，同時(shí)臨床研究也發(fā)現(xiàn)了丁苯酞在帕金森病患者中也有一定的療效，但藥理作用涉及許多復(fù)雜的分子機(jī)制，有待進(jìn)一步研究。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑人神經(jīng)母細(xì)胞瘤(SH-SY5Y)細(xì)胞(購(gòu)自于上海酶研生物有限公司)、丁苯酞(購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究所，藥物純度>99.98%)、MPP+(購(gòu)自美國(guó)Sigma公司)、NO試劑盒(購(gòu)自上海碧云天公司)、α-突觸核蛋白及β-actin一抗(購(gòu)自affinity生物公司)。

1.2 主要儀器CO2恒溫培養(yǎng)箱、-80 ℃冰箱、4 ℃低溫離心機(jī)、低溫高速離心機(jī)、酶標(biāo)儀、100～1000 μL微量移液器、分析天平、電子顯微鏡(日本OLYMPUS-IX71)、蛋白電泳和轉(zhuǎn)膜設(shè)備、凝膠成像系統(tǒng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將SH-SY5Y細(xì)胞株置于DMEM/F12=1∶1(含10 %的胎牛血清)的培養(yǎng)基，37 ℃，5% CO2孵育箱中培養(yǎng)，每2～3 d細(xì)胞換液1次，鏡下觀察細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%時(shí)可以進(jìn)行傳代及相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化 使用前期實(shí)驗(yàn)的最適濃度結(jié)果來(lái)處理細(xì)胞。Control組：正常含血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；MPP+組：1 mmol/L MPP+培養(yǎng)24 h；丁苯酞組：10 μmol/L丁苯酞預(yù)處理保護(hù)3 h后加入1 mmol/L MPP+處理直至24 h。模型構(gòu)建完成后，鏡下觀察各組細(xì)胞的狀態(tài)，并采集照片。

1.3.3 細(xì)胞NO濃度的檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞，消化并調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為5×104個(gè)/mL，接種于96孔板中，每孔100 μL，設(shè)4個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)液處理細(xì)胞；分組如下：Control組、MPP+組、丁苯酞組；取出Griess Reagent I和II放置至室溫，用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。標(biāo)準(zhǔn)品的濃度取0、1、2、5、10、20、40、60、100 μM，在96孔板中加入標(biāo)準(zhǔn)品及各實(shí)驗(yàn)組的上清液50 μL/孔，最后每孔內(nèi)加入50 μL Griess Reagent I和Griess Reagent II，酶標(biāo)儀540 nm測(cè)定OD值，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可確定樣品中NO的濃度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.3.4 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以1×106個(gè)/孔接種于六孔板中，按照1.3.2分組處理成功后棄去培養(yǎng)基，PBS輕輕沖洗2遍，用加入PMSF的RIPA裂解液冰上裂解30 min，提取細(xì)胞內(nèi)總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。根據(jù)蛋白分子量，配制15 %分離膠，80 V 30 min，120 V 60 min進(jìn)行蛋白分離。濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5 %的脫脂奶粉封閉120 min，加入一抗4 ℃孵育過(guò)夜。次日，TBST沖洗3次后二抗室溫孵育1 h。TBST洗膜3次后用ECL發(fā)光液進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影，β-actin 作為內(nèi)參。應(yīng)用Image J軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度值比較。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化鏡下觀察細(xì)胞，A組為正常細(xì)胞，大部分呈多邊形，少數(shù)細(xì)胞呈圓形，有些細(xì)胞可見(jiàn)長(zhǎng)的突起，有分枝，并相互交叉構(gòu)成網(wǎng)絡(luò)，貼壁能力強(qiáng)；與A組相比，B組細(xì)胞總體數(shù)量減少，細(xì)胞突起明顯減少、縮短，折光性改變，貼壁能力降低，出現(xiàn)漂浮死亡的細(xì)胞；加入丁苯酞保護(hù)后C組中細(xì)胞損傷程度有所減輕，存活細(xì)胞數(shù)量增加，貼壁能力增強(qiáng)，漂浮死亡細(xì)胞減少，見(jiàn)圖1。

圖1 各組細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)(×100)

2.2 丁苯酞抑制SH-SY5Y細(xì)胞NO的生成檢測(cè)結(jié)果表明，與Control組相比，MPP+組細(xì)胞內(nèi)NO濃度增加(P<0.001)；加入丁苯酞保護(hù)后，細(xì)胞內(nèi)NO濃度降低(P<0.001)，提示丁苯酞可以抑制細(xì)胞內(nèi)NO的生成，見(jiàn)圖2。

圖2 丁苯酞對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)NO生成的影響

2.3 丁苯酞減少SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)α-突觸核蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果表明，與Control組相比，MPP+組可以觀察到α-突觸核蛋白的表達(dá)明顯增加(P<0.001)；丁苯酞加入保護(hù)后，與MPP+組相比，α-突觸核蛋白的表達(dá)降低(P<0.001)；提示丁苯酞可以抑制細(xì)胞內(nèi)α-突觸核蛋白的表達(dá)，對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用，見(jiàn)圖3。

圖3 丁苯酞對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)α-突觸核蛋白表達(dá)的影響

3 討論

PD發(fā)病主要見(jiàn)于中老年人群，以靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩、姿勢(shì)步態(tài)異常等為主要臨床表現(xiàn)，除此之外還有嗅覺(jué)、自主神經(jīng)、認(rèn)知異常等非運(yùn)動(dòng)癥狀[3]。發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，臨床治療難度高。到目前為止，盡管有不同的預(yù)防策略可以在一定程度上緩解帕金森病相關(guān)癥狀，但無(wú)法最終治愈帕金森病。伴隨著我國(guó)老齡化基本國(guó)情的加快，帕金森病的不可治愈性、病理過(guò)程的復(fù)雜性、巨大的醫(yī)療費(fèi)用、心理負(fù)擔(dān)的產(chǎn)生，尤其是晚期常常表現(xiàn)為癡呆癥和獨(dú)立生活能力的喪失，甚至是殘疾，嚴(yán)重影響帕金森病患者的日常生活質(zhì)量[4]。目前，帕金森病的發(fā)病原因及具體機(jī)制仍然不清楚，而氧化應(yīng)激在神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要推動(dòng)作用[5-6]。

SH-SY5Y細(xì)胞(人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞)，能夠分泌TH、多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等活性物質(zhì)，在生理、生化許多方面都與多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞極為相似，符合帕金森的病理學(xué)特征，并且相對(duì)而言易獲得和培養(yǎng)[7]。MPP+化學(xué)結(jié)構(gòu)與多巴胺相似，它可以穿過(guò)血腦屏障作用于多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞，誘發(fā)神經(jīng)炎癥、氧化物增加、金屬離子增加。因此目前被廣泛應(yīng)用于研究帕金森病的多巴胺能神經(jīng)元模型[8]。

在前期實(shí)驗(yàn)中通過(guò)CCK8法測(cè)細(xì)胞存活率已經(jīng)獲得MPP+組的最適濃度為1 mmol/L，丁苯酞的最適濃度為10 μmol/L，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行下一步相關(guān)機(jī)制的探究。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)MPP+處理后，SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)氧化物NO明顯增加，說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)處于高氧化應(yīng)激狀態(tài)，且帕金森病理學(xué)標(biāo)志性物α-突觸核蛋白表達(dá)顯著增加。但是經(jīng)過(guò)丁苯酞預(yù)處理保護(hù)3 h后，與MPP+組相比，觀察到細(xì)胞內(nèi)NO減少，α-突觸核蛋白表達(dá)也降低，說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)由MPP+引起的氧化應(yīng)激被有效改善，同時(shí)還抑制了SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)α-突觸核蛋白的聚集。

綜上所述，實(shí)驗(yàn)證實(shí)了丁苯酞的預(yù)處理對(duì)神經(jīng)元確實(shí)存在一定的抗氧化作用，抑制神經(jīng)毒性對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞的損傷，但其中具體的保護(hù)機(jī)制需要進(jìn)一步挖掘。