一氧化氮對間歇性主動飲酒大鼠戒斷后再飲酒時酒精偏好的影響

楊 濤，高 青，張洪艷，王琦玉，王 雪，徐璐璐，熊君偉，關艷中

(牡丹江醫學院，黑龍江 牡丹江 157011)

酒精使用障礙(Alcohol use disorders，AUD)是全球最普遍的精神障礙之一，研究酒精導致機體適應性改變的相關分子機制和特定神經回路，對于臨床治療和預防具有重要作用[1]。AUD涉及許多腦區，其中VTA是已知與酒精獎賞效應密切相關的腦區[2]。一氧化氮(NO)是中樞神經系統和外周神經系統最重要的信號分子之一[3]。有研究表明，NO參與飲酒行為，腹腔注射NO合酶抑制劑L-NAME抑制NO的形成可降低酒精依賴大鼠酒精攝入量和偏好[4]。但與酒精獎賞行為密切相關的VTA區NO是否調控飲酒行為還未見報道。本研究通過向VTA注射NO信號阻斷劑，觀察間歇性主動飲酒大鼠再次飲酒時的酒精偏好，明確VTA中NO對酒精偏好的影響，從而為臨床治療及預防提供理論依據。

1 材料及方法

1.1 實驗動物成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，體重為180～220 g。購自哈爾濱醫科大學動物實驗中心，實驗動物生產許可證號：SYKX(黑)2015-007。SD大鼠單籠飼養于SPF級動物房，溫度(22±2)℃，環境濕度56%左右，保持晝夜節律12 h/12 h(即早8:00到晚20:00)。籠中食物和水充足，通風系統良好。所有動物飼養與使用均已通過《美國國立衛生研究院實驗動物護理和使用指南》以及符合牡丹江醫學院實驗動物管理條例。

1.2 實驗試劑及制備無水乙醇(濃度≥95%)，C-PTIO(美國Sigma公司)，L-NAME(美國Sigma公司)，C-PTIO、L-NAME使用0.9%生理鹽水溶解。

1.3 20%酒精間歇性主動飲酒模型的建立大鼠在SPF級動物房單籠飼養適應一周后，在第1 d，大鼠給予兩個瓶子，一瓶裝有20%(容積比v/v)酒精，另外一個瓶子裝有等量飲用水，記錄兩個瓶子的位置。24 h后，記錄大鼠飲水量(mL)和飲酒量(mL)，然后將20%的飲酒瓶用裝有等量飲用水的水瓶置換出來，此時籠內均為飲水瓶；第3天，再用20%酒精瓶替換其中一瓶飲用水，并且交換20%酒瓶和水瓶的位置(與第1天位置相反)，以防止大鼠對飲用溶液的位置偏好。如此重復28 d。

1.4 酒精偏好的測定建模成功后，大鼠酒精戒斷72 h后，再次給予20%酒精，記錄再次飲酒時6 h內的飲酒量與飲水量。酒精偏好的計算為消耗的酒精量占總液體消耗量的百分比，即酒精偏好(%)=酒精消耗總量(mL)/(酒精消耗總量+水的消耗總量)(mL)×100%[5]。

1.5 實驗動物分組及處理雄性SD大鼠30只，隨機分為對照組(n=6)和飲酒組(n=24)。對照組大鼠給予兩個等量飲用水瓶，每天記錄飲水量。飲酒組大鼠按照1.3的方法建立酒精依賴模型。在第21天對照組與飲酒組大鼠進行腦立體定位埋置套管后，繼續飲用水或20%酒精至28 d。飲酒組和對照組大鼠定期進行稱重并記錄體重。飲酒組建模成功后酒精戒斷72 h，隨機分為假手術組(正常做手術但VTA內不注射藥物)、L-NAME組(每側VTA按照0.5 μg/0.5 μL注入NO合酶抑制劑L-NAME)、C-PTIO組(每側VTA按照1 μg/0.5 μL劑量注入NO清除劑C-PTIO)、生理鹽水組(每側VTA微量注射0.5 μL生理鹽水)。微量注射時間為60 s，藥物注射后留針60 s以便藥物擴散。然后測定6 h內的飲酒偏好。

1.6 統計學處理實驗結果使用SPSS 23.0統計軟件，所有數據“均數±標準差”表示。數據作圖采用 GraphPad Prism 7.0，不同組間使用One way ANOVA進行分析比較。多個樣本均數間兩兩比較采用SNK法檢驗，P<0.05 被認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 間歇性主動飲酒模型的建立

2.1.1 SD間歇性主動飲酒模型建立期間飲酒組體重變化 建模期間，對照組和飲酒組體重比較，發現實驗前飲酒組與對照組大鼠體重比較無顯著性差異(t=1.03，P=0.32)。實驗結束時飲酒組體重與對照組大鼠體重比較亦無顯著性差異(t=0.12，P=0.90)。提示酒精不影響大鼠生長及體重變化，見圖1。

圖1 飲酒組與對照組大鼠體重變化

2.1.2 SD大鼠間歇性主動飲酒模型的建立 結果顯示，隨著飲酒次數的增加，SD大鼠酒精攝入量(圖2A)與飲酒偏好(圖2B)逐漸升高，最終維持在穩定基線，提示酒精依賴模型構建成功，見圖2。

圖2 飲酒組大鼠酒精攝入量、酒精偏好變化

2.2 NOS抑制劑L-NAME對飲酒偏好的影響L-NAME注射后，6 h內酒精偏好比較結果顯示，與生理鹽水組和假手術組相比，L-NAME組酒精偏好明顯降低，差異具有統計學意義(F2,15=38.89，P<0.001)，見圖3。

圖3 L-NAME注射后6 h內酒精偏好變化

2.3 NO清除劑C-PTIO對飲酒偏好的影響C-PTIO注射后，6 h內酒精偏好比較。結果顯示，與生理鹽水組和假手術組相比，C-PTIO組酒精偏好明顯降低，且差異具有統計學意義(F2,15=37.56，P<0.001)，見圖4。

圖4 C-PTIO注射后6 h內酒精偏好變化

3 討論

AUD包括酒精依賴與酒精成癮，是一種復雜的慢性疾病，在高收入和中等收入國家尤為突出，會造成巨大的個人和社會經濟負擔[6]。對酒精相關刺激的反應性增強和執行功能受損是AUD的標志[7]。因此研究酒精在體內誘發的神經適應對于臨床治療及預防具有重要作用。

持續飲酒可誘導AUD模型[8]。但在AUD的臨床前研究中，一個主要的挑戰仍然是通過何種飲酒模式，以引出實驗動物攝入高飲酒量，并模擬從低或中度飲酒到過度飲酒的漸進轉變。20%酒精間歇性主動飲酒模型是一種低成本、簡單、易得的酒精攝取方案，可有效誘導幾種遠交系大鼠(包括SD大鼠)自愿飲用大量酒精從而構建酒精依賴模型，以便更深入地了解酒精獎賞效應相關機制[9]。自愿酒精攝入量和飲酒偏好的增加是20%酒精間歇性主動飲酒模型的主要特征。與之前報道類似，本實驗中發現隨著飲酒范例的增加，SD大鼠的酒精攝入量和酒精偏好穩定增加，提示成功建立大鼠酒精依賴模型。此外，有研究報道間歇性酒精攝入戒斷后會導致動物隨后攝入更多的酒精[10]，我們前期研究也發現20%酒精間歇性主動飲酒模型中，酒精戒斷72 h后大鼠再飲酒量顯著增加。因此在本研究中，SD大鼠在酒精戒斷72 h后對VTA進行微量注射。

AUD是由參與酒精獎賞效應的特定神經回路調節[11]，有研究表明NO信號通路之間的密切相互作用可能是導致AUD發生的神經生化基礎[12]，干預NO信號可能對治療AUD有益。因此為了明確與酒精獎賞效應密切相關的VTA中NO對酒精偏好的影響，我們向酒精依賴大鼠VTA微量注射了NO清除劑C-PTIO、NO合酶抑制劑L-NAME，結果顯示C-PTIO與L-NMAE均可以明顯降低SD大鼠戒斷后再次飲酒時的酒精偏好，提示NO可能對飲酒行為具有調控作用。

綜上所述，我們發現20%酒精間歇性主動飲酒可以誘導SD大鼠酒精依賴，VTA微量注射C-PTIO或者L-NAME均可以明顯降低大鼠戒斷后再次飲酒時的酒精偏好，提示NO涉及的信號通路可能參與了飲酒行為，對AUD的臨床治療及預防具有指導意義。