基于響應面法對抗腫瘤乳酸菌培養條件的優化

◎靳瑾健，丁 琳，郭 皓

（1.黑龍江省農墾齊齊哈爾管理局中心醫院藥劑科，黑龍江 齊齊哈爾 161000；2.齊齊哈爾醫學院科研處，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

乳酸菌是能利用碳水化合物發酵產生大量乳酸的一類細菌[1]，研究表明一些乳酸菌可以調節機體胃腸道微生態平衡，增強免疫力，降低膽固醇，抗氧化抗腫瘤等[2]，因此常被用作功能性食品成分。隨著人們健康意識及安全意識的提高，將高效、低毒的乳酸菌作為天然制劑開發已成為研究熱點。目前，乳酸菌的抗腫瘤作用機制研究主要集中于阻斷自由基鏈的傳遞過程，阻斷自由基的產生，從而抑制腫瘤發生發展[3]。FUKUI[4]等研究發現乳酸菌可明顯降低腫瘤細胞的發生率。AZAM[5]等研究發現乳酸菌培養的上清液可抑制乳腺癌細胞相關基因的表達，由此可見，有些乳酸菌不但本身有抗腫瘤的作用，其代謝產物也具有抗腫瘤的功能[6]。因此本研究選取乳酸菌代謝產物為研究對象，通過單因素試驗和響應曲面分析方法優化培養條件，以觀察其抗腫瘤活性，為乳酸菌的開發利用提供理論依據，為生產功能性乳制品研發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳酸菌G5（本實驗室分離得到的一株活性乳酸菌）；MTT（美國Amersco 公司）、DMEM 培養基（美國Gibco 公司）、酶標儀（F-4500，瑞士Tecan 公司）、大容量高速冷凍離心機（Z36HK，德國Hermle 公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳酸菌的培養

取甘油保藏的乳酸菌菌株接種于MRS 培養基中，30 ℃、120 r·min-1培養48 h，活化3 代后，用于后續試驗。

1.2.2 細胞抗腫瘤實驗

乳酸菌抗腫瘤實驗采用MTT 實驗的腫瘤抑制率為指標進行篩選。人乳腺癌細胞MCF-7 接種于96 孔板，乳酸菌代謝產物作用48 h，培養結束每孔加20 μL MTT溶液，孵育3 h 后離心去上清，加150 μL 二甲基亞砜（DMSO），置搖床上低速振蕩10 min 后，利用酶標儀570 nm 檢測波長檢測各組吸光度并計算細胞的抑制率。抑制率=（1-實驗組吸光度/對照組吸光度）×100%。

1.2.3 單因素試驗

采用單因素試驗初步探究抗腫瘤乳酸菌的培養條件，研究蛋白胨添加量（5 g·L-1、10 g·L-1、15 g·L-1、20 g·L-1和25 g·L-1）、葡萄糖添加量（10·L-1、20·L-1、30·L-1、40·L-1和50 g·L-1）、接種量（1%、3%、5%、7%和10%）、培養溫度（20 ℃、25 ℃、30 ℃、37 ℃和42 ℃）、培養時間（24 h、32 h、48 h、60 h 和72 h）及培養基pH（5.5、6.0、6.5、7.0 和7.5）對腫瘤細胞抑制率的影響。

1.2.4 Plackett-Burman 試驗設計

根據單因素的試驗結果，選擇影響乳酸菌培養的6 個因素（蛋白胨添加量、葡萄糖添加量、接種量、培養溫度、培養時間和培養基pH）作為評價因素，以腫瘤細胞抑制率Y作為響應值，應用Design-Expert 8.0軟件設計Plackett-Burman（PB）試驗。

1.2.5 Box-Behnken 試驗設計

根據PB 試驗結果，選擇顯著影響乳酸菌培養的3 個因素（蛋白胨添加量、培養基pH、培養時間）作為自變量，以腫瘤細胞抑制率Y作為響應值，應用Design-Expert 8.0 軟件設計進行Box-Behnken（BBD）試驗。

1.3 統計分析

響應面試驗設計使用Design Expert 8.0；統計分析使用SPSS 19.0。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

各因素對腫瘤細胞抑制率的影響見表1。根據單因素試驗結果，選擇蛋白添加量為15 g·L-1，葡萄糖添加量為30 g·L-1，接種量為5%，選擇培養溫度為37 ℃，培養時間為48 h，最適培養基pH 為6.5。

表1 單因素試驗結果表

2.2 PB 試驗分析

單因素試驗的基礎上，PB 試驗設計及結果見表2，回歸分析結果見表3。

表2 Plackett-Burman 試驗設計及結果表

表3 Plackett-Burman 試驗回歸分析結果表

由表3 可知，模型的F值為9.77，P 值為0.012 1（P＜0.05），模型項顯著，表明該模型具有重要意義。該模型的決定系數R2=0.921 4，信噪比=10.525 2（＞4），表示此模型具有良好的預測能力。各個變量對腫瘤細胞抑制率影響的顯著程度依次為F ＞D ＞A ＞C ＞E ＞B，利用軟件對表3 的數據進行分析，得到模型擬合方程：Y=37.37+3.51A-0.875 0B+1.71C+5.45D+1.45E+6.15F，由回歸方程可知，培養基pH、培養時間和蛋白胨添加量3 個因素顯著地影響腫瘤細胞的抑制率，因此選擇這3 個因素進行BBD 試驗。

2.3 BBD 試驗分析

在PB 試驗的基礎上，BBD 試驗設計水平結果見表4，回歸分析見表5。

表4 Box-Behnken 試驗設計及結果表

表5 Box-Behnken 試驗回歸分析結果表

由表5 可知，回歸模型F值為27.12，P=0.000 1（P＜0.05），模型差異極顯著，該模型的決定系數R2=0.972 1，信噪比=14.622（＞4），表明此模型具有很強的預測能力。模型失擬項無顯著性差異（P=0.283 1 ＞0.05），說明該模型的擬合度較好，由此可以判斷，BBD 試驗設計是可靠的。利用軟件對表4 的數據進行分析，得到模型擬合方程：Y=48.38+2.22A+3.56D+3.25F+1.59AD-0.50AF-1.97DF-6.77A2-6.83D2-4.35F2。各因素之間的交互作用對腫瘤細胞抑制率的影響如圖1所示。

圖1 各因素變化對腫瘤細胞抑制率的交互作用圖

2.4 驗證試驗

由BBD 試驗可得出，抗腫瘤乳酸菌最佳培養條件是蛋白胨添加量為20.90 g·L-1，培養時間為38.34 h，培養基pH 為6.65，在此條件下，預測的腫瘤細胞抑制率實際值為49.50%，根據實際情況對其進行調整，培養條件是蛋白胨添加量為20 g·L-1，培養時間為38 h，培養基pH 為6.7，測出的實際腫瘤細胞抑制率為46.54%，與預測值無顯著差異（P＞0.05）。

3 結論

本試驗以乳酸菌代謝產物抑制腫瘤細胞生長為指標，從中優化乳酸菌的培養條件。通過單因素試驗分析和響應面試驗優化，得到最佳的培養條件：蛋白胨添加量為20 g·L-1，培養時間為38 h，培養基pH 為6.7，對腫瘤細胞的抑制率達到了46.54%，此研究為乳酸菌代謝產物抗腫瘤的應用提供了理論依據，使乳酸菌的應用前景愈加廣闊。