響應面法優化酶解制備魚皮膠原寡肽

◎王 霞，畢桂燦，賴園園

（1.廣東食品藥品職業學院 生物技術學院，廣東 廣州 510000；2.華南農業大學新能源與新材料研究所，廣東 廣州 510000；3.安徽國肽生物科技有限公司，安徽 宣城 242000）

膠原蛋白是人體內一種重要的結構蛋白，廣泛分布于皮膚、骨、韌帶等組織中[1]。膠原蛋白分子具有獨特的三股螺旋結構[2]，分子量大難以被人體吸收。膠原寡肽是將膠原蛋白進行水解后得到的小分子產物，易被人體吸收，具有抗氧化、美容、降血壓等功效，在化妝品、食品工業、醫學材料等領域的應用日益廣泛[3]。膠原蛋白水解主要有化學法和酶解法，化學法對寡肽結構和氨基酸破壞嚴重，導致產物活性低，污染嚴重；酶解法反應過程溫和，對膠原肽結構沒有被破壞，極大地保留了產物的活性[4]。本研究以鯪魚魚皮為原料，采用SCAU 膠原蛋白復合酶水解制備膠原寡肽，并通過單因素和響應面試驗優化其酶解反應條件，為魚皮酶解制備膠原肽提供一定的技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SCAU 膠原蛋白復合酶和鯪魚魚皮，由華南農業大學生物質工程研究所提供。NaOH、HCl、甲醛均為分析純，活性炭為食品級。魚皮洗凈，刮去魚皮表面魚鱗和脂肪，剪成小塊，于50 ℃烘箱烘干，保存于-20 ℃下備用。

1.2 儀器與設備

D1型自動蒸汽滅菌鍋，BT1248 分析天平，1810D型自動雙重純水蒸餾器，XMT-DA 水浴鍋。

1.3 實驗方法

1.3.1 酶解制備膠原寡肽

稱取2 g 干魚皮，121 ℃高壓滅菌15 min，按料液比1∶9（g∶mL）加入無菌水，調節pH 值，加入SCAU 膠原蛋白復合酶液于水浴鍋中水解數小時后，加入0.2 g 活性炭粉于沸水浴中保溫5 min 終止酶解，冷卻至室溫，抽濾，濾液冷凍干燥后得膠原寡肽粉。反應條件根據單因素實驗進行調整。

1.3.2 提取率的計算

稱量冷凍干燥后的膠原寡肽粉質量，膠原寡肽提取率計算公式為：

1.3.3 酶解制備魚皮膠原寡肽單因素試驗

根據預實驗，選擇加酶量（0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL 和1.0 mL）、時間（2 h、3 h、4 h、5 h 和6 h）、溫度（45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃和65 ℃）、pH 值（6.0、7.0、8.0、9.0 和10.0）作為因素，分別測定4 個因素對魚皮膠原肽提取率的影響。

1.4 響應面實驗設計

采用Box-Behnken 試驗設計，將魚皮膠原寡肽提取率設為響應值，得到4 因素3 水平試驗設計模型如表1所示。

表1 Box-Behnken 試驗因素及水平表

2 結果與分析

2.1 酶解制備膠原寡肽單因素試驗

2.1.1 加酶量對膠原寡肽提取率的影響

加酶量對魚皮膠原寡肽提取率的影響如圖1所示。隨著加酶量的增加，膠原寡肽提取率逐漸升高，當加酶量為0.6 mL 時膠原寡肽提取率最高，之后略有下降。原因可能是隨著反應體系中酶濃度的升高，反而會抑制水解的進行，從而使肽提取率下降[5]。因此，選擇加酶量0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL 作為研究水平。

圖1 加酶量對膠原寡肽提取率的影響圖

2.1.2 酶解時間對膠原寡肽提取率的影響

酶解時間對魚皮膠原寡肽提取率的影響如圖2所示。隨著時間的增加，膠原寡肽提取率逐漸升高，至酶解時間為4 h 時提取率最高，繼續增加酶解時間提取率基本上維持不變。原因可能是隨著保溫時間的延長，膠原蛋白酶的穩定性受到影響，活性逐漸喪失，無法再催化蛋白的水解[6]。因此，選擇酶解時間3 h、4 h、5 h 作為研究水平。

圖2 酶解時間對魚皮膠原肽提取率的影響圖

2.1.3 酶解溫度對魚皮膠原寡肽提取率的影響

酶解溫度對魚皮膠原寡肽提取率的影響如圖3所示。當酶解溫度為55 ℃時，寡肽提取率最高，酶解溫度為65 ℃時寡肽提取率最低，原因可能是該膠原蛋白酶的最適溫度約為55 ℃，溫度偏低，不利于酶與底物的結合與反應；該膠原復合酶對高溫較為敏感，溫度過高，易導致酶變性失活，提取率下降。因此，選擇50 ℃、55 ℃、60 ℃作為研究水平。

圖3 酶解溫度對魚皮膠原肽提取率的影響圖

2.1.4 pH 值對魚皮膠原寡肽提取率的影響

pH 值對魚皮膠原寡肽提取率的影響如圖4所示。結果表明，當pH 值為8.0 時，寡肽提取率最高，pH值低于或者高于8，提取率都會下降。原因可能是該酶最適pH 約為8，當反應體系pH 值偏離最適pH 時，該膠原蛋白復合酶的活性都會顯著降低，反應速度減慢。因此，選擇pH 7.0、pH 8.0、pH 9.0 作為研究水平。

圖4 pH 值對魚皮膠原肽提取率的影響圖

2.2 酶解制備魚皮膠原寡肽結果與分析

2.2.1 酶解制備魚皮膠原肽數學模型的建立與顯著性檢驗

根據單因素試驗結果，利用Design-Expert 12.0.1.0響應面軟件進行組合設計，考查加酶量（A）、時間（B）、溫度（C）、pH 值（D）對魚皮膠原寡肽提取率（Y）的影響，試驗組合及各組合下得到的膠原寡肽提取率結果見表2。

表2 試驗設計及結果表

通過軟件對表2 數據進行回歸擬合分析，以魚皮膠原寡肽提取率為目標函數的二次回歸方程為：Y=21.95+0.342 5A+0.799 2B-0.393 3C+2.70D+0.190 0AB-0.020 0AC-0.552 5AD-0.087 5BC-0.075 0BD+0.052 5CD-1.86A2-2.26B2-2.65C2-5.20D2。對表2 數據進行顯著性檢驗，結果見表3。

表3 顯著性檢驗分析表

由表3 可知，此模型P值遠小于0.01，說明此模型極顯著，誤差很小，故此模型可代替真實值對魚皮膠原寡肽提取率進行分析。在回歸模型中，對酶解制備魚皮膠原寡肽影響為極顯著的為一次項D，二次項B2、C2、D2，而一次項B 和二次項A2對酶解制備魚皮膠原寡肽影響為顯著。影響魚皮膠原寡肽提取率大小因素依次為pH 值＞時間＞溫度＞加酶量。

對該回歸模型進行可信度分析，復相關系數R2=95.20%，修正相關系數R2Adj=90.41%，Y變異系數為6.14%，試驗值與理論值相關性高，說明此模型可靠性高。

2.2.2 因素間相互作用響應面分析

響應面圖能夠反映出4 個因素之間的相互關系以及作用程度[7]，結果如圖5所示。各響應曲面的最高點位于等高線最小橢圓的中心點或附近[8]，說明加酶量、時間、溫度和pH 值各因素之間存在的相互作用不顯著。

圖5 魚皮膠原寡肽提取響應面圖

2.2.3 酶解制備魚皮膠原肽參數優化

根據Design Expert12.0.1.0 軟件的計算，最優酶解反應條件為：加酶量0.61 mL（即每克魚皮（干）加酶0.305 mL）、酶解時間4.18 h、酶解溫度54.62 ℃、pH 值8.25，魚皮膠原寡肽提取率預測為22.39%?？紤]到實際方便及易操作性，將酶解反應條件設定為：每克魚皮（干）加酶0.305 mL、時間4.2 h、溫度54.6 ℃、pH 值8.2。在此條件下進行3 次平行試驗，酶解制備魚皮膠原肽平均提取率為22.58%。

3 結論

本方法利用SCAU 膠原蛋白復合酶水解鯪魚魚皮提取膠原寡肽，并采用Box-Behnken 響應面法優化酶解反應條件參數。結果表明此魚皮膠原蛋白酶解的最佳條件為每克魚皮（干）加酶0.305 mL、酶解時間4.2 h、酶解溫度54.6 ℃、pH 值8.2。在此酶解反應條件下進行3 次平行試驗，魚皮膠原肽提取率平均為22.58%。方差分析結果表明，影響魚皮膠原寡肽提取率大小因素依次為pH 值、水解時間、水解溫度和加酶量，交互項對魚皮膠原肽提取率影響不顯著。