納豆菌菌粉復水工藝優化研究

◎嚴美婷，張 良

（江西省食品發酵研究所，江西 宜春 336000）

納豆是大豆經納豆菌發酵而成的一種傳統食品，納豆中含有納豆激酶，其作用廣泛，具有抗血栓、降血壓、抗腫瘤等多種生理功能[1-3]。高活力的納豆菌既可以縮短發酵時間，減少發酵過程中的污染，減少成本，也能提高納豆激酶酶活性，因此提高納豆菌的發酵活力至關重要。

納豆菌菌粉相比較于液態種子液，其明顯優勢是污染小，且使用更加便捷。從成本考慮，降低了菌種存放的條件，在低溫干燥的環境下可保存。但納豆菌菌粉由于經過干燥處理，其細胞及活力都受到了損傷，因此在進行發酵或繁殖之前，必須對其復水活化，恢復損傷的細胞，經一定時間的培養后恢復其正常的生理功能[4-5]。目前納豆菌的研究主要集中在納豆激酶高產菌株的選育及液態發酵條件的優化，以及添加輔佐材料及一些化學藥品對納豆激酶酶活產生的影響，而忽略了納豆菌菌粉的復水活化條件對納豆菌發酵活力的影響[6]。因此掌握納豆菌菌粉的復水活化機理，選擇合適的復水活化條件對提高納豆菌的發酵活力至關重要。

本文對納豆菌菌粉的復水活化工藝進行研究，通過單因素和正交試驗優化其復水工藝，以期尋找出最佳的納豆菌菌粉復水活化條件，提高其發酵活力，進而為納豆食品的生產及制備提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

納豆菌菌粉，江西省食品發酵研究所微生物實驗室保存；脫脂乳粉，光明脫脂奶粉；牛肉膏、蛋白胨，北京奧博星生物技術有限責任公司；酵母膏（分析純），杭州微生物試劑二廠；可溶性淀粉（分析純），廣東汕頭市西隴化工廠。

1.2 培養基

牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基：牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，瓊脂1.5%～2.5%，NaCl 0.5%，pH 為7.4～7.6。

發酵液培養基：可溶性淀粉3%，酵母膏2%，K2HPO40.01%，KH2PO40.01%，CaCl20.05%，pH 為6.5。

1.3 儀器與設備

BXM-30R 立式壓力蒸汽鍋（上海博訊實業有限公司）、UV-9100 紫外可見分光光度計（北京瑞利分析儀器公司）、BS224S 電子天平（賽多利斯科學儀器（北京）有限公司）、SHP-160 型生化培養箱（上海三發科學儀器有限公司）、TGL-16G 臺式離心機（長沙湘智離心機儀器有限公司）、HH-4 恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）及SPH-304 恒溫搖床（上海世平實驗有限公司）。

1.4 單因素實驗

1.4.1 復水劑種類的選擇

以無菌水、生理鹽水、納豆菌培養種子液、黃豆汁以及4%、8%和12%的脫脂乳粉作為復水活化劑，將納豆菌菌粉以1∶200 的比例（W/V）與復水劑混合，置于32 ℃的恒溫箱中復水活化60 min 后用平板菌落計數法計算活菌數[7]，再將其接種至發酵液中進行液態發酵[8]，用福林酚法[9]測定發酵液中納豆激酶酶活，從而確定最佳的復水劑種類。

1.4.2 菌粉與復水劑比例的選擇

將納豆菌菌粉與復水劑分別按1∶50、1∶100、1∶150、1∶200、1∶250、1∶300 和1∶350 的比例混合，置于32 ℃恒溫箱中復水活化60 min，測定活菌數及發酵液中納豆激酶酶活，從而確定最佳的比例。

1.4.3 復水時間的選擇

將納豆菌菌粉與復水劑以1∶200 的比例（W/V）混合后置于32 ℃恒溫箱中分別復水活化20 min、40 min、60 min、80 min、100 min 和120 min，測定活菌數及發酵液中納豆激酶酶活，從而確定最佳的復水時間。

1.4.4 復水溫度的選擇

將納豆菌菌粉與復水劑以1∶200 的比例（W/V）混合后分別置于20 ℃、24 ℃、28 ℃、32 ℃、36 ℃、40 ℃和44 ℃的恒溫箱中復水活化60 min，測定活菌數及發酵液中納豆激酶酶活，從而確定最佳的復水溫度。

1.5 正交優化實驗

根據單因素實驗結果，分別選取納豆菌菌粉與復水劑比例（A）、復水溫度（B）和復水時間（C）3 個因素進行正交優化實驗。其正交實驗水平因素設計見表1。

表1 正交實驗水平因素設計表

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果與分析

2.1.1 復水劑種類對納豆菌菌粉復水活化的影響

由圖1 可知，不同的復水劑對納豆菌菌粉復水活化的效果不同，無菌水對菌粉的復水活化效果最差，以8%脫脂乳和12%脫脂乳作為復水劑時效果最好，菌粉復水活化后活菌數及納豆激酶酶活較高，其中兩者的活菌數相差較小，而以8%脫脂乳為復水劑時納豆激酶酶活高于12%脫脂乳復水劑，故選擇8%脫脂乳粉作為最佳復水劑。

圖1 復水劑種類對納豆菌菌粉復水活化的影響圖

2.1.2 菌粉與復水劑的比例對納豆菌菌粉復水活化的影響

由圖2 可知，活菌數隨菌粉與復水劑比例升高呈下降趨勢，這是由于隨著復水劑含量的增加，菌粉的含量相對減少所導致。而納豆激酶酶活呈先增加后下降趨勢，當比例為1∶100 時酶活最高，為629.325 U·mL-1，這說明在此比例下復水劑對菌粉的復水效果最好，復水活化后納豆菌的活力最強。故綜合數據分析，選擇該比例前后接近的梯度1∶75、1∶100、1∶125 作為該因素3 個水平進行正交實驗。

圖2 菌粉與復水劑的比例對納豆菌菌粉復水活化的影響圖

2.1.3 復水溫度對納豆菌菌粉復水活化的影響

由圖3 可知，活菌數和納豆激酶酶活隨著復水溫度的升高都呈先升高后降低的趨勢，納豆菌菌粉在36 ℃條件下復水后活菌數最高，在40 ℃條件下復水活化后納豆激酶酶活最高，但此溫度下的活菌數與36 ℃條件下的活菌數相差不大，因此綜合考慮選擇32 ℃、36 ℃、40 ℃作為該因素3 個水平進行正交實驗。

圖3 復水溫度對納豆菌菌粉復水活化的影響圖

2.1.4 復水時間對納豆菌菌粉復水活化的影響

由圖4 看出，從20～60 min 這段時間納豆菌活菌數和納豆激酶酶活增加明顯，當菌粉復水60 min后其活菌數和納豆激酶酶活達到最高，活菌數達5.051×108CFU·mL-1，發酵后酶活達587.924 U·mL-1。繼續增加復水時間，活菌數和納豆激酶酶活都下降，說明復水時間過長，反而對納豆菌菌粉活化不利。綜上分析，選擇以60 min 為基準上下10 min 為梯度的3 個水平：50 min、60 min、70 min 作為該因素3 個水平進行正交實驗。

圖4 復水時間對納豆菌菌粉復水活化的影響圖

2.2 正交優化實驗結果

對正交實驗數據進行分析處理，正交實驗結果見表2，方差分析見表3。由表2 可知，Rc＞RA＞RB，則表明各因素對實驗影響大小為C ＞A ＞B，由表3可知菌粉與復水劑比例和復水時間對納豆激酶酶活的影響顯著（P＜0.05），復水溫度對酶活的影響不顯著（P＞0.05）。由表4 可知，A2與A3差異不顯著，與A1差異顯著，較佳水平為A2（k2最大），B 因素的各水平對納豆激酶酶活力的影響無差異，但較佳水平為B2，C2與C3、C1間差異顯著，較佳水平為C2，故納豆菌菌粉的最佳復水工藝方案為A2B2C2。經實驗驗證得出采用此工藝納豆菌菌粉復水活化后活菌數達5.268×108CFU·mL-1，納豆激酶酶活達750.062 U·mL-1，因此納豆菌菌粉的最佳復水工藝為：以8%的脫脂乳粉作為復水活化劑，發酵劑與復水劑比例為1∶100，復水溫度為36 ℃，復水時間為60 min。

表2 正交試驗結果表

表3 方差分析結果表

表4 多重比較結果表

3 結論

納豆菌菌粉在用于發酵納豆前需進行復水活化，恢復細胞的正常功能。本文采用單因素及正交實驗對納豆菌菌粉的復水活化工藝進行了優化，確定了菌粉最佳復水活化工藝為：以8%脫脂乳粉為復水劑，發酵劑與復水劑比例為1∶100，復水溫度為36 ℃，復水時間為60 min，在此條件下納豆菌菌粉經復水活化后活菌數達到了5.268×108CFU·mL-1，用于液態發酵時納豆激酶酶活達750.062 U·mL-1。

此復水工藝有效地提高了納豆菌菌粉的活性，從而有利于提高納豆及其制品的生產效率及其穩定性。