益生菌對體外循環致大鼠肺損傷影響研究

初 奇，李俞羲，曹惠鵑，孫瑩杰，刁玉剛，張鐵錚

1.錦州醫科大學 北部戰區總醫院 研究生培養基地，遼寧 沈陽110016；2.北部戰區總醫院 麻醉科，遼寧 沈陽 110016

肺損傷是體外循環(cardiopulmonary bypass，CPB)心臟手術后常見的并發癥，嚴重者可出現成人呼吸窘迫綜合征[1-2]。CPB過程中，腸道和肺是炎性因子的主要釋放器官及靶器官。腸道是全身炎性反應的“始動器官”和“原動力”，肺是全身炎性反應過程中最早出現功能障礙的器官之一[3]。而腸源性細菌、內毒素移位是多器官功能障礙綜合征或急性呼吸窘迫綜合征的始動因素。有研究表明，益生菌能夠降低小兒急性肺損傷血清炎性因子水平并減輕肺損傷程度[4]。本研究通過建立大鼠CPB肺損傷模型，旨在探討益生菌對CPB所致肺損傷的影響，為臨床減輕CPB所致肺損傷提供參考。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 選取30只清潔級健康雄性SD大鼠為研究對象，12周齡，體質量320～420 g，由北部戰區總醫院實驗動物科提供。采用完全隨機數字表法將大鼠分為假手術組(S組)、CPB組(C組)，益生菌組(P組)，每組各10只。本研究對大鼠的各項處置均符合動物倫理學標準。

1.2 研究方法 動物飼養環境如下：安靜，空氣清新，溫濕度適宜(溫度18～25℃，相對濕度55%～60%)，12 h光暗循環。每天更換墊料，飼養期間動物可自由飲食和飲水。CPB開始前7 d，P組每日清晨用益生菌(麗珠醫藥集團，由雙歧桿菌、乳酸桿菌和嗜熱鏈球菌組成，每片含活菌數5×107CFU)2 ml灌胃，S組與C組用生理鹽水2 ml灌胃；第8天C組和P組行動靜脈置管并進行CPB轉流60 min，S組僅置管不轉流。

1.3 模型制備腹腔注射 2%戊巴比妥鈉30 mg/kg對大鼠進行麻醉，氣管插管(16 G套管針)成功后連接小動物呼吸機(江西省特力麻醉呼吸設備公司，TKR-200C型)行機械通氣，潮氣量3 ml/100 g，通氣頻率60次/min，吸呼比1.0∶1.5，同時監測大鼠的體溫、心電及血氧飽和度。經左股靜脈穿刺置管(22 G套管針)，建立靜脈補液通路；經尾動脈穿刺置24 G套管針，實時測量動脈壓；右頸靜脈穿刺置管，并將導管尖端置于心房(18 G，多側孔以便引流)；右股動脈置管22 G套管針用于心肺轉流。置管后立即股經靜脈給予肝素5 mg/kg，活化凝血時間值達到400～500 s行CPB。CPB環路由貯血器、BT00-300M型恒流蠕動泵(保定蘭格恒流泵有限公司)、微型膜氧合器(廣東科威醫療器械有限公司)及連接管道組成。CPB采用無血預充液16 ml，由乳酸鈉林格液7 ml、琥珀酰明膠7 ml、15%甘露醇1 ml和5%碳酸氫鈉1 ml組成。轉流期間根據血氣情況調節內環境，維持平均動脈壓>60 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，pH值7.35～7.45，動脈二氧化碳分壓35～45 mmHg，堿剩余-3～3 mmol/L。轉流達到1 h后，緩慢減小轉流量直至停止，啟動呼吸機，重新恢復機械通氣。停機前經股靜脈注射1∶1魚精蛋白中和多余肝素，依動脈血氣結果適量補充鈣和鉀，根據情況給予去甲腎上腺素維持血壓穩定。實驗過程中維持大鼠體溫在35.5℃～36.5℃。CPB結束后2h生命體征平穩視為模型建立成功[5]。

1.4 標本采集及檢測指標 CPB結束2 h后抽取大鼠股動脈血進行血氣分析。脊髓脫臼法處死大鼠后，抽取門靜脈血1ml，2 500 r/min離心15 min，測定血漿二胺氧化酶(diamine oxidase，DAO)、D-乳酸、內毒素、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白細胞介素6(interleukin 6，IL-6)水平。無菌條件下取腔靜脈血約100 μl，接種于血平皿培養基上；取肝、肺、腎組織、腸系膜淋巴結0.1～0.2 g，放入盛有1 ml生理鹽水的無菌研磨管中研碎成懸液，取20 μl接種于培養基上培養。24 h后由檢驗科專業技師應用全自動生化反應儀器(法國梅里埃公司，VITEK-2 COMPACT 60型)鑒定有無細菌生長及細菌種類，計算細菌易位發生率。取0.5 g右上肺葉組織，置于天平記錄精確重量，記為濕重，然后放入恒溫干燥箱，72 h后稱重，記為干重，計算兩者的比值，用于肺水腫評估。取左肺，經甲醛固定，石蠟包埋，HE染色等步驟，觀察病理學變化并進行肺損傷評分[6]。

2 結果

2.1 各組大鼠血液指標比較 C組與P組大鼠D-乳酸、內毒素、TNF-α、IL-6、DAO均顯著高于S組，且C組高于P組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血漿指標比較

2.2 各組大鼠細菌易位發生率比較 檢測各組大鼠50個部位，共檢出大腸桿菌、腸球菌、棒狀桿菌及變形桿菌4種細菌53株，均屬腸道常駐菌。S組、C組和P組細菌易位發生率分別為6%(3/50)、66%(33/50)、34%(17/50)。C組與P組細菌易位發生率高于S組，且C組高于P組，差異均有統計學意義(P<0.05)。

2.3 各組大鼠肺損傷病理表現 S組大鼠肺組織結構清晰完整，未見明顯異常；C組大鼠部分肺泡壁斷裂、肺泡腔塌陷，可見炎性細胞、紅細胞和水腫液滲出；P組大鼠肺泡間隔增寬，肺泡毛細血管擴張，少量炎性細胞及紅細胞滲出。見圖1。

圖1 各組大鼠肺損傷病理表現(a.S組；b.C組；c.P組；HE×200)

2.4 各組大鼠肺功能指標比較 C組、P組大鼠肺損傷評分、濕/干重比值、呼吸指數明顯高于S組，且C組高于P組，差異有統計學意義(P<0.05)。C組、P組大鼠氧合指數明顯低于S組，且C組低于P組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血氣指標及肺功能指標比較

3 討論

CPB所致肺損傷是心臟手術常見的并發癥之一[7]。CPB過程中，全身炎性反應是激活的補體系統、內毒素血癥和炎性因子共同作用的結果。CPB期間，腹腔臟器較大腦等重要臟器更早、更顯著地出現血流量減少，處于低灌注、低氧狀態，導致腸道屏障功能損傷[8]。腸黏膜屏障功能受損是全身炎性反應綜合征、多器官功能障礙綜合征的重要誘因。而肺是全身炎性反應過程中最早出現功能障礙的器官之一[9]。有研究表明，口服益生菌可降低老年肋骨骨折患者肺炎發生率，改善肺功能，且無明顯不良反應[10]。另有研究表明，口服益生菌通過增加體液免疫和細胞免疫，可增加小鼠抵抗流感病毒的能力[11]。本研究將益生菌用于CPB大鼠，觀察其對CPB大鼠肺損傷的影響。

益生菌是對健康有益的活菌補充劑，利用益生菌的內源性防御屏障和免疫性防御屏障作用拮抗致病菌來保護腸黏膜屏障，降低內毒素濃度、減少菌群易位和脂質過氧化等[12]。DAO是哺乳動物腸黏膜上層絨毛細胞胞質中具有高度活性的細胞內酶。DAO在外周血中活性穩定，是反映黏膜上皮細胞成熟度和完整性的血漿標志物[13]。當腸黏膜上皮細胞受到損傷后，DAO釋放入血液，導致血漿DAO水平升高。D-乳酸是胃腸道固有細菌的產物，正常情況下很少被機體吸收，在腸黏膜損害和通透性增加后可入血液。因此，血液中D-乳酸水平可以反映腸黏膜損害狀況和通透性的變化程度[14]。本研究結果表明，預先給予大鼠服用益生菌，可降低血漿DAO活性和D-乳酸水平，減少CPB對腸黏膜屏障的破壞，降低腸黏膜通透性。本研究結果表明，CPB可使大鼠血漿內毒素水平及遠隔臟器細菌易位發生率顯著升高，而預先給予益生菌可顯著降低血漿內毒素水平及腸道菌常駐菌的易位發生率。本研究結果還表明，預先給予益生菌可降低CPB誘發的血漿TNF-α和IL-6水平升高，在一定程度上減輕CPB引起的全身炎性反應，減輕CPB致大鼠肺損傷程度，表現為氧合指數升高，呼吸指數下降，肺組織含水量下降，肺泡、肺泡腔和肺泡間隔的病理學改變均明顯減輕。

綜上所述，益生菌可在一定程度上改善CPB后大鼠腸屏障功能，減輕CPB所致全身炎性反應，進而減輕CPB所致大鼠肺損傷，起到保護肺組織、改善肺功能的作用。