脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)放射性碘131誘導(dǎo)后大鼠甲狀腺功能減退影響

郝珊瑚，戰(zhàn) 瑩，王治國(guó)，武曉丹，張國(guó)旭

北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，遼寧 沈陽(yáng) 110016

甲狀腺功能減退是由于甲狀腺激素合成及分泌減少導(dǎo)致的機(jī)體代謝降低的一種疾病，臨床表現(xiàn)為皮膚干燥、脫發(fā)、便秘、易疲勞、睡眠障礙、抑郁等[1-2]，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。近年來(lái)，甲狀腺切除術(shù)及放射性碘131(131Iodine,131I)治療導(dǎo)致的永久性甲狀腺功能減退不斷增加，臨床多采用甲狀腺素替代治療，而長(zhǎng)期服用甲狀腺素會(huì)影響部分患者的身心健康。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)是從脂肪組織中分離出來(lái)的具有自我更新與多向分化潛能的多能干細(xì)胞。有研究表明，ADSCs可分泌多種生物活性因子，在組織損傷、修復(fù)方面具有重要作用[3]。本研究建立甲狀腺功能減低癥大鼠模型，旨在探討ADSCs治療甲狀腺功能減退的可行性及有效性。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 40只6周齡雄性SD大鼠(購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司)，體質(zhì)量150～172 g。飼養(yǎng)于北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)科，飼養(yǎng)溫度18℃～23℃，相對(duì)濕度40%～70%，自由飲水?dāng)z食。每周觀察大鼠生存狀態(tài)，包括毛發(fā)情況、精神狀態(tài)、活動(dòng)情況、飲食飲水情況等，測(cè)量并記錄大鼠體質(zhì)量變化。

1.2 模型構(gòu)建及實(shí)驗(yàn)分組 40只大鼠隨機(jī)分成4組：陰性對(duì)照組，腹腔注射0.5 ml生理鹽水；131I模型組，腹腔注射250 μCi131I加入生理鹽水至0.5 ml；藥物對(duì)照組，在131I模型組基礎(chǔ)上，每天給予左甲狀腺素鈉片水溶液0.5 ml進(jìn)行灌胃治療；ADSCs治療組，在131I模型組基礎(chǔ)上，4周后接受ADSCs移植。

1.3 干細(xì)胞的制備及移植 將人ADSCs細(xì)胞無(wú)菌條件下分離純化獲得脂肪組織，于37℃，5%CO2條件下，體外培養(yǎng)擴(kuò)增4～7代細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表面標(biāo)記物，并進(jìn)行細(xì)胞分化功能檢測(cè)，最終確定為合格細(xì)胞制品。ADSCs治療組尾靜脈注射ADSCs混懸液0.1 ml(密度為1×106個(gè)/ml)。

1.4 甲狀腺激素及炎性因子水平檢測(cè) 收集眼眥靜脈血1 ml，置聚丙烯EDTA抗凝管中，4℃下，以3 000 r/min離心10 min，取血清保存于-80℃冰箱中。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清中促甲狀腺激素(thyroid stimulating hormone，TSH)、游離三碘甲狀腺原氨酸(free triiodothyronine，F(xiàn)T3)、游離甲狀腺素(free thyroxine，F(xiàn)T4)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)、白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)及白細(xì)胞介素10(interleukin-10，IL-10)水平。實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。吸光度值采用美國(guó)BIO-RAD伯樂(lè)550型酶標(biāo)儀測(cè)量，波長(zhǎng)為450 nm。

1.5 甲狀腺131I靜態(tài)顯像 大鼠接受不同組內(nèi)干預(yù)措施后，腹腔注射10%水合氯醛進(jìn)行麻醉，仰臥位固定，充分顯露頸部。分別向各組大鼠腹腔注入131I-碘化鈉顯像劑20 μCi，顯像劑由中國(guó)工程物理研究院物理與化學(xué)研究所提供。注射24 h后，行甲狀腺131I靜態(tài)顯像。甲狀腺131I靜態(tài)顯像采用德國(guó)Siemens公司Symbia T16 SPECT/CT儀，采用高能平行孔準(zhǔn)直器，采集矩陣128×128，每幀采集300 K計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量變化比較 實(shí)驗(yàn)前，4組大鼠的體質(zhì)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。陰性對(duì)照組大鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中體質(zhì)量持續(xù)增長(zhǎng)，其他3組大鼠注射131I后，體質(zhì)量增加緩慢，131I模型組與藥物對(duì)照組大鼠在第6周后，出現(xiàn)體質(zhì)量下降趨勢(shì)，而ADSCs治療組大鼠在干細(xì)胞移植后，體質(zhì)量逐漸上升。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠體質(zhì)量變化比較

2.2 各組大鼠血清甲狀腺激素水平比較 注射131I前，各組大鼠TSH、FT3、FT4水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。注射131I后，藥物對(duì)照組、131I模型組、ADSCs治療組大鼠的FT3、FT4水平均低于陰性對(duì)照組，TSH水平高于陰性對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與131I模型組比較，藥物對(duì)照組與ADSCs治療組大鼠的FT3水平均升高，F(xiàn)T4水平均降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；藥物對(duì)照組與ADSCs治療組大鼠的TSH水平均低于131I模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠注射131I后血清甲狀腺激素水平比較

2.3 各組大鼠炎性因子水平比較131I模型組大鼠的TNF-α、IL-6水平明顯高于陰性對(duì)照組，1L-10水平明顯低于陰性對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。ADSCs治療組大鼠的TNF-α、IL-6水平顯著低于131I模型組，IL-10水平顯著高于131I模型組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。131I模型組與藥物對(duì)照組大鼠的TNF-α、IL-6、IL-10水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠炎性因子水平比較

2.4 甲狀腺131I靜態(tài)顯像結(jié)果 注射131I前，各組大鼠甲狀腺均顯影清晰，大鼠輪廓清晰。注射131I后，各組大鼠輪廓清晰，甲狀腺區(qū)未見(jiàn)明顯放射性分布。藥物對(duì)照組服用左甲狀腺素鈉后，甲狀腺區(qū)未見(jiàn)明顯核素增濃，但ADSCs治療組經(jīng)過(guò)干細(xì)胞治療，甲狀腺床區(qū)可見(jiàn)放射性計(jì)數(shù)增加，甲狀腺較淡顯影。見(jiàn)圖3。

圖3 ADSCs治療組大鼠甲狀腺131I靜態(tài)顯像結(jié)果(a.注射131I前，大鼠輪廓清晰，可見(jiàn)消化道顯影，甲狀腺顯影清晰；b.注射131I后，大鼠輪廓清晰，可見(jiàn)消化道顯影，甲狀腺不顯影；c.移植干細(xì)胞后，大鼠輪廓清晰，可見(jiàn)消化道顯影，甲狀腺較淡顯影)

3 討論

甲狀腺是人體內(nèi)最大的內(nèi)分泌腺體，其功能是合成與分泌甲狀腺激素，調(diào)節(jié)人體正常物質(zhì)及能量代謝，促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育。當(dāng)甲狀腺激素合成和分泌不足時(shí)，即發(fā)生甲狀腺功能減退。有研究表明，甲狀腺功能減退可導(dǎo)致心血管功能異常，顯著增加心血管疾病的發(fā)生率，還可引起血脂代謝紊亂、血壓升高，進(jìn)而導(dǎo)致Ⅱ型糖尿病的發(fā)生[3-4]。131I可以在體內(nèi)參與甲狀腺激素的合成和代謝過(guò)程，并放射β射線，對(duì)甲狀腺組織產(chǎn)生電離輻射作用，使濾泡細(xì)胞變性壞死，因此，臨床上利用131I治療甲狀腺疾病。本研究采用腹腔注射放射性131I的方法建立甲狀腺功能減低癥大鼠模型，具有操作簡(jiǎn)便、成功率高、對(duì)機(jī)體損傷小的優(yōu)點(diǎn)，可以避免手術(shù)造模實(shí)驗(yàn)動(dòng)物存活率低的不足，同時(shí)可以減少化學(xué)誘導(dǎo)方法對(duì)大鼠其他器官的損害。

ADSCs是一類(lèi)具有自我更新和多向分化潛能的多能干細(xì)胞，可以分化形成不同類(lèi)型的組織器官的細(xì)胞，從而修復(fù)受損的組織[5-6]。通過(guò)體外培養(yǎng)，ADSCs可以被誘導(dǎo)分化成甲狀腺細(xì)胞，并且具有甲狀腺激素分泌功能[7]。本研究結(jié)果顯示，與131I模型組比較，藥物對(duì)照組與ADSCs治療組大鼠的FT3水平均升高，F(xiàn)T4水平均降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；藥物對(duì)照組與ADSCs治療組大鼠的TSH水平均低于131I模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這可能是因?yàn)檠錞SH水平較FT4更敏感，在發(fā)生甲狀腺功能減退早期，F(xiàn)T4還未檢測(cè)到異常時(shí)，TSH已經(jīng)發(fā)生改變[8]。TNF-α、IL-6、IL-10等是由免疫細(xì)胞及組織細(xì)胞經(jīng)刺激而分泌的具有生物學(xué)活性的小分子蛋白質(zhì)，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)揮各種功能的作用，對(duì)于維持機(jī)體正常的生理狀態(tài)和抗御各種損傷具有重要意義[9]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，131I模型組大鼠的TNF-α、IL-6水平明顯高于陰性對(duì)照組，1L-10水平明顯低于陰性對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這提示，131I誘導(dǎo)大鼠發(fā)生甲狀腺功能減退引起了機(jī)體的炎癥反應(yīng)，影響了免疫平衡及穩(wěn)定。TNF-α、IL-6的過(guò)度增殖與免疫細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)相關(guān)，在甲狀腺功能減退發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中具有重要作用。TNF-α主要來(lái)源于單核巨噬細(xì)胞，可以抑制TSH的釋放，減少FT3、FT4的釋放，調(diào)節(jié)甲狀腺細(xì)胞的增殖[10]。IL-6主要來(lái)源于成纖維細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及單核細(xì)胞，具有多種生物活性，在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、造血系統(tǒng)、急性期反應(yīng)與神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)等方面具有重要作用。有研究表明，IL-6濃度在甲狀腺功能減退的大鼠中增加[11]。Mikos等[12]報(bào)道，甲狀腺功能減退患者的TNF-α水平高于空白對(duì)照組，TNF-α被認(rèn)為是甲狀腺功能減退的標(biāo)志物。IL-10主要由Th2細(xì)胞產(chǎn)生，可抑制巨噬細(xì)胞的活性，從而起到抗自身免疫炎癥的作用[13-14]。本研究結(jié)果顯示，ADSCs治療組大鼠的TNF-α、IL-6水平顯著低于131I模型組，IL-10水平顯著高于131I模型組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。以上結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)干細(xì)胞治療后，大鼠的炎性因子水平有所改善，但直接補(bǔ)充甲狀腺激素僅能調(diào)節(jié)激素水平，并不能改善大鼠的炎性因子水平。甲狀腺131I靜態(tài)顯像結(jié)果顯示，131I模型組與藥物對(duì)照組未見(jiàn)甲狀腺顯影，ADSCs治療組輕微可見(jiàn)甲狀腺顯影。這提示，經(jīng)干細(xì)胞治療后，濾泡細(xì)胞功能部分恢復(fù)，行使其生理功能，這可能是因?yàn)锳DSCs移植到大鼠體內(nèi)促使甲狀腺分泌功能增強(qiáng)，或其本身分化生成具有一定生物學(xué)功能的甲狀腺細(xì)胞，但具體原因有待進(jìn)一步探究。

綜上所述，ADSCs移植可能會(huì)促進(jìn)甲狀腺激素的分泌，改善甲狀腺的攝碘功能，對(duì)于放射性131I誘導(dǎo)后大鼠甲狀腺功能減退具有一定的潛在治療作用，其機(jī)制可能與促進(jìn)IL-10的分泌有關(guān)。