小檗堿對心肌纖維化心房重構影響及機制研究

王 洋，張 建，楊忠路，蘭 懷，王輝山

1.遼寧中醫藥大學，遼寧 沈陽 110847；2.北部戰區總醫院 心血管外科，遼寧 沈陽 110016

心房顫動的病理生理機制高度復雜且多變，不同的危險因素在特定的個體中促發不良的心房重構過程，從而導致心房顫動[1-2]。心房顫動的維持與心房重構密切相關，心房重構包括電重構與結構重構，共同構成心房顫動發生與持續的病理基礎。心房增大及心肌纖維化被認為是心房顫動相關結構重構的標志[3-4]。心房顫動可促進心房纖維化[5-7]。因此，防止心肌纖維化的形成對心房顫動的治療具有重要意義。有研究表明，小檗堿是治療心血管疾病最有前途的天然產物衍生藥物之一，可通過激活觸發各種信號通路以防治心血管疾病[7-10]。既往研究發現，小檗堿可抑制心肌纖維化的發展[11-12]。本研究通過建立心房纖維化模型，探討小檗堿對心肌纖維化心房重構的影響及機制。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑 選取30只普通級健康雄性新西蘭大耳白兔為研究對象，體質量2.8～3.2 kg，購自青島康大生物科技有限公司。鹽酸小檗堿(東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司)；免疫組化試劑盒(江蘇凱基生物技術股份有限公司)；α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)抗體(Immunoway YM3365)；Masson三色染色液(珠海貝索生物技術有限公司)；蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)染液(江蘇凱基生物技術股份有限公司)；2.4 GHz科研型植入式動物遙測刺激系統、植入子(型號：Ensense-2.4G)、六通道接收機系統(型號：Ensense-2.4G)。本研究對白兔的處置符合動物倫理學標準。

1.2 分組及模型制備 采用隨機數字表法將其分為左心房快速起搏組(RAP組)、左心房快速起搏+小檗堿組(RAP+BBR組)、假手術組(SHAM組)、假手術+小檗堿組(SHAM+BBR組)、空白對照組(Control組)，每組各6只。RAP+BBR組及SHAM+BBR組術前給予小檗堿100 mg/(kg·d)灌胃，1次/d，持續1周。RAP組、SHAM組、Control組均給予等量生理鹽水灌胃，1次/d，持續1周。術后給予發放間歇電刺激。具體參數設定為：刺激2 s暫停2 s、頻率20 Hz、強度2 mA、脈寬1 ms。按此程序刺激2周。同時RAP+BBR組及SHAM+BBR組給予小檗堿灌胃(同術前)，持續2周。RAP組、SHAM組、Control組均給予等量生理鹽水灌胃(同術前)。給予兔陸眠寧Ⅱ和咪達唑侖麻醉后，剪開左側中上腹部皮膚至皮下層，制作皮下囊袋置入植入子，4根電極導線經皮下隧道延伸，在兩側腋下皮下縫置兩個心電采集電極，觀察心電圖。經三肋間開胸，剪開心包，兩個刺激電極分別縫合于左心耳和左心房上，兩個電極間至少保持10 mm距離，縫合切口。應用青霉素鈉抗感染。實驗兔恢復后，開啟動物遙測刺激系統，通過無線收發采集和刺激信號，利用PowerLab生理記錄儀連續監測體表I導聯心電信號，通過專用計算機程序刺激軟件，發放間歇電刺激。各組實驗兔均在術后2周處死，摘取整個左心房組織，稱重，部分心房心肌應用4%多聚甲醛浸泡固定，后期脫水包埋蠟塊。部分液氮速凍后置于-80℃的冰箱中保存備用。

1.3 組織學分析 切取4～5 μm的石蠟切片，進行Masson染色及膠原容量分數(collagen volume fraction，CVF)計算，評估纖維化面積。測量藍色區域顯示纖維化，紅色標記心肌細胞。另取4～5 μm切片進行HE染色，評估心肌細胞的膠原纖維變化。

1.4 免疫組織化學測定 心房組織標本切成4～5 μm切片，在二甲苯和乙醇中脫蠟至水，抗體在4℃過夜。磷酸緩沖鹽溶液處理后，滴加羊抗兔二抗，二氨基聯苯胺顯色，蘇木素復染，封片。

1.5 α-SMA表達的檢測 將心房組織勻漿，離心。采用二喹啉甲酸蛋白測定試劑盒(上海鉑萊生物科技有限公司)定量總蛋白。蛋白質在10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺變性凝膠上裝載與分離，轉移到聚偏二氟乙烯膜上。分別用β-actin(1∶1 000，Abcam)、α-SMA(1∶500，Immunoway)一抗在4℃過夜。經TBST洗滌后，加5%牛血清白蛋白稀釋熒光二抗，室溫下孵育1 h。采用全自動凝膠成像分析系統(上海天能科技有限公司)進行定量。

2 結果

2.1 小檗堿對各組實驗兔左房質量的影響 RAP組左房質量顯著高于其他各組，差異有統計學意義(P<0.05)；SHAM+BBR組左房質量高于Control組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 小檗堿對各組實驗兔左房質量影響

2.2 各組心房組織Masson染色及CVF定量分析 各組心房組織Masson染色結果見圖2。膠原纖維呈藍色，心肌細胞呈紅色。RAP組心肌纖維化面積增多。RAP+BBR組心肌間質纖維化較RAP組明顯減輕。SHAM組與SHAM+BBR組纖維化程度相當。Control組心肌纖維排列整齊，細胞核大小正常。CVF定量分析顯示，與Control組比較，其他各組心肌間質纖維化明顯增加(P<0.05)，RAP+BBR組膠原纖維數量較RAP組明顯減少(P<0.05)，SHAM組與SHAM+BBR組膠原纖維數量相當(P>0.05)。見圖3。

圖2 各組心房組織標本Masson染色分析(HE×20)

圖3 CVF定量分析染色結果

2.3 各組心房組織HE染色結果 Control組心肌纖維排列整齊致密，細胞核清晰，細胞外基質減少，而RAP組心肌纖維萎縮、排列紊亂，并有大量炎癥細胞浸潤。與RAP組比較，RAP+BBR組上述病理改變明顯減輕。SHAM組與SHAM+BBR組病理改變程度相當，介于RAP+BBR組與Control組之間。見圖4。

圖4 各組心房組織HE染色結果(HE×20)

2.4 RAP組與RAP+BBR組心房組織中α-SMA表達情況 RAP+BBR組心房組織α-SMA表達明顯低于RAP組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖5～6。

圖5 RAP組與RAP+BBR組心房組織中α-SMA與β-actin蛋白印跡圖

3 討論

心房重構，特別是間質纖維化，是心房顫動發生的重要因素[13]。心房重構包括電重構與結構重構，心房纖維化是心房顫動主要病理改變之一。心房增大和心肌纖維化是心房結構重構的主要特征[14]，該過程是不可逆的。心功能改變與心肌間質膠原過度沉積是心肌纖維化的特征，心房組織中CVF為臨床上心肌纖維化程度的指標[15]。成纖維細胞分化為肌成纖維細胞的標記物是α-SMA。α-SMA的表達對心房顫動產生了明顯的影響，并且會引起心房結構重構[16]。

本研究發現，造模2周后，RAP組心房質量明顯增大，RAP+BBR組心房重量較RAP組明顯減小。Masson染色發現，RAP+BBR組心肌纖維化程度較RAP組明顯減輕。以上結果提示，小檗堿能抑制RAP組心房纖維化。免疫組化結果顯示，與RAP組比較，RAP+BBR組α-SMA陽性細胞數量顯著減低，α-SMA表達水平受到抑制，說明小檗堿治療改善了這一變化。本研究證實，單獨的RAP可以引起膠原纖維在心房肌中的表達，提示心房顫動期間的心動過速可能引起心房纖維化導致的心房重構，同時伴有左房質量的增加。小檗堿可通過抑制a-SMA表達，有效抑制RAP誘導的心房纖維化和伴隨的心房顫動易感性。

圖6 半定量分析α-SMA表達

綜上所述，小檗堿可能通過減輕心肌纖維化，進而產生預防心房顫動的作用，為心肌纖維化與心房顫動的治療提供新的治療靶點。