腎病綜合征患者血清miR-21表達變化及意義

姜姣姣，汪正翔，朱亞寧，董雄軍

蕪湖市第二人民醫院腎臟內科，安徽蕪湖241000

腎病綜合征是較常見的一種臨床綜合征，主要由多種原因導致的腎小球基底膜通透性增加，造成大量血漿白蛋白從尿液中流失，進而導致機體發生一系列病理生理改變的疾病［1］。該病的主要臨床特征為水腫、大量蛋白尿、高脂血癥、低蛋白血癥等，隨著病情的發展，可導致各種并發癥如急性腎功能衰竭等，給患者的生命健康造成重大影響［2］。然而，目前對腎病綜合征病因和發病機制尚未完全明確。微小RNA（miRNA）是廣泛存在于生物體內的一種非編碼小RNA，經轉錄后可調控基因的表達，且在細胞增殖、分化、凋亡等多種生物學過程中發揮重要作用［3-4］。多項研究發現，多種miRNA在腎病綜合征的發生及發展中發揮重要作用。然而，有關微小RNA-21（miR-21）對腎病綜合征的影響尚不清楚。基于此，本研究擬通過檢測腎病綜合征患者血清miR-21的表達，探究其在腎病綜合征中的作用，以期為臨床診治腎病綜合征提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年5月—2020年3月在本院腎病內科確診并治療的腎病綜合征患者150例為腎病綜合征組。納入標準：符合2008年出版的《內科學》中有關腎病綜合征的相關診斷標準［5］，并經病理檢查確診；入院前未接受其他藥物治療；臨床資料完整。排除標準：狼瘡性腎炎、乙肝病毒相關性腎炎、銀屑病相關腎炎等繼發性腎病綜合征；嚴重內分泌疾病；嚴重心肝等功能障礙；感染性疾病。150例患者中，男84例，女 66例；年齡18～75（42.83 ±5.27）歲；體質量指數（BMI）21.83～22.49 kg/m2。同期選取在本院進行常規體檢的健康志愿者150例作為對照組，男79例，女 71例；年齡17～76（43.11 ±5.23）歲；BMI 21.25～22.38 kg/m2。兩組臨床資料比較差異無統計學意義（P＞0.05）。該研究經本院醫學倫理委員會批準；患者及家屬簽署知情同意書。

1.2 樣品采集及保存 于清晨采集兩組空腹靜脈血5 mL，用JIDI-16R型離心機（廣州吉迪儀器有限公司）以3 000 r/min離心15 min（離心半徑8 cm），收集上層血清，置于-20℃冰箱保存待測。

1.3 腎功能指標檢測 用全自動生化儀檢測兩組血尿素氮、血肌酐及尿酸水平。

1.4 血清miR-21表達檢測 采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）法。取出待測血清，按照RNA提取試劑盒說明書步驟提取總RNA，逆轉錄得cDNA。RNA提取試劑盒購于北京甘棠飛華生物科技有限公司，逆轉錄試劑盒購于上海伯易生物科技有限公司。以上述逆轉錄合成的cDNA為模板，進行qRT-PCR檢測，V115896實時熒光定量PCR儀購于美國Applied Biosystems公司。PCR反應體系20 μL。反應條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 35 s，72℃20 s，共35個循環。miR-21及U6引物均由蘇州鴻訊生物科技有限公司合成。miR-21正向引物5'-GTTAGCTTATCAGACTGA-3'，反向引物 5'-GTGCAGGGTCCGAGGTAT-3'；U6 正 向 引 物 5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'，反 向 引 物 5'-GGAACGCTTCACGAATTTA-3'。 采 用 2-ΔΔCT法 計 算血清miR-21相對表達量。

1.5 血清TGF-β1、IL-18檢測 采用ELISA法檢測血清TGF-β1、IL-18（ELISA試劑盒購于上海遠慕生物科技有限公司）。步驟：將已配制好的100μL標準樣品分別加入標準孔和空白孔，于37℃溫育30 min后洗滌。將酶標板內液體棄去，拍干后加入酶標試劑，再37℃溫育30 min，洗滌后加入顯色劑并混合均勻，使其進行顯色。最后加入終止液，用酶標儀測定其吸光度（OD值），然后根據標準品濃度和OD值畫出標準曲線，采用Curve Expert軟件制作標準曲線，計算TGF-β1、IL-18濃度。

1.6 統計學方法 采用SPSS22.0統計軟件。計量資料以xˉ±s表示，比較采用t檢驗；用Pearson相關分析法分析腎病綜合征患者血清miR-21與TGF-β1、IL-18的相關性，相關系數（r）0.1～0.3為弱相關，0.3～0.5為中等相關，0.5～1.0為強相關；用受試者工作特征（ROC）曲線評估血清miR-21對腎病綜合征的診斷價值；用Logistic回歸分析腎病綜合征發生的影響因素。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組腎功能指標比較 與對照組比較，腎病綜合征組血尿素氮、血肌酐、尿酸水平高（P均＜0.05）。見表1。

表1 兩組腎功能指標比較（μmol/L，±s）

組別腎病綜合征組對照組t P n 150 150血尿素氮20.35±2.13 4.14±1.12 82.497＜0.05血肌酐326.48±32.16 38.72± 6.81 107.21＜0.05尿酸315.42±73.41 279.47±60.52 4.628＜0.05

2.2 兩組miR-21、TGF-β1、IL-18比較 與對照組比較，腎病綜合征組miR-21及TGF-β1、IL-18水平高（P均＜0.05）。見表2。

表2 兩組miR-21、TGF-β1、IL-18比較（-x± s）

2.3 腎病綜合征患者血清miR-21與TGF-β1、IL-18表達的相關性 Pearson法分析結果顯示，腎病綜合征患者血清miR-21與細胞因子TGF-β1、IL-18表達均呈正相關（r分別為0.418、0.452，P均＜0.05）。

2.4 血清miR-21對腎病綜合征的診斷價值 血清miR-21診斷腎病綜合征的曲線下面積為0.852（95%CI：0.809～0.894），最佳截斷值為0.91，此時對應靈敏度和特異度分別為77.3%、78.7%。

2.5 腎病綜合征發病的影響因素 以腎病綜合征是否發生為因變量（0=否，1=是），血清miR-21、血尿素氮、血肌酐及尿酸為自變量，采用Logistic回歸分析，結果顯示：血清 miR-21（OR=3.652，95%CI：1.684～7.921，P＜0.05）、血尿素氮（OR=2.869，95%CI：1.395～5.902，P＜0.05）、血 肌 酐（OR=2.928，95%CI：1.592～5.386，P＜0.05）是腎病綜合征發生的影響因素。見表3。

表3 腎病綜合征發生的危險因素分析

3 討論

腎病綜合征是慢性腎臟病中的常見類型，研究顯示該疾病約占腎活檢病例的40%，具有發病率高、病情復雜、患者預后差等特點。腎病綜合征的典型特征為大量蛋白尿、高脂血癥和低蛋白血癥，而患者大量蛋白尿長期得不到有效控制，可導致發展為終末期腎病［6］。流行病學研究顯示，近年來隨著環境、生活方式的變化及人口老齡化問題越來越嚴重，腎病綜合征呈逐年增加的趨勢，嚴重危害患者的健康，且給患者家庭生活帶來很大影響。然而，目前對該疾病的發病機制并不完全明確。因此，對腎病綜合征進行深入研究，以尋找有效的疾病標志物，對早期診斷和治療具有重要臨床意義。

miRNA是一類廣泛存在于真核生物中的長度為19～25 nt的單鏈非編碼小分子RNA，它能以特定方式抑制蛋白質合成，誘發RNA降解，調節基因的轉錄和表達，并參與機體多種生物學過程［7］。大量研究已證實，miRNA在多種疾病如癌癥、心血管疾病及腎臟疾病的發生及發展中發揮重要作用［8］。朱媛媛等［9］研究發現，miR-150在兒童腎病綜合征患者血清中表達水平顯著升高，且與患兒腎功能損傷、血脂指標密切相關。駱峻等［10］研究發現，腎病綜合征患兒腎組織中miR-191表達水平升高，miR-151-3p表達水平降低，且其表達水平與臨床血清指標肌酐、總膽固醇等密切相關。以上研究表明miRNA在腎病綜合征患者中異常表達，與腎病綜合征的發生有關。miR-21是較早發現的一種在人體細胞及組織中廣泛存在的miRNA，位于17q23.2染色體的FRA17B脆性區域上，并具有自主轉錄單位。研究證實，miR-21與多種疾病發生發展密切相關［11］。鐘開義等［12］研究發現，miR-21在急性腎損傷患者血清中表達水平升高，且其表達水平與患者病情嚴重程度相關。王雪艷等［13］研究發現，miR-21是多種腎臟病變的調節因子，在慢性腎臟病、多囊腎、急性腎損傷、腎性腫瘤、糖尿病腎病中表達水平升高，因此下調miR-21的表達可作為一種潛在的治療策略。本研究結果發現，腎病綜合征組血清miR-21表達水平顯著高于對照組，提示血清miR-21可能參與腎病綜合征的發展進程。

近年來研究發現，多種疾病的發生發展與機體內各種細胞因子的異常變化密切相關。TGF-β1是機體內一種較常見的細胞因子，可調控細胞的增殖、分化，參與炎癥反應，并可導致多臟器官纖維化［14］。IL-18是IL家族的重要成員之一，是一種重要的內環境調節因子，可參與炎癥反應及免疫應答等［15］。程力平等［16］研究發現，兒童原發性腎病綜合征患兒血清TGF-β1和IL-18 mRNA水平升高，且活動期患兒二者水平均高于緩解期，監測兩者水平有助于鑒別疾病類型。本研究發現，腎病綜合征組血清細胞因子TGF-β1、IL-18水平均顯著高于對照組，提示血清細胞因子TGF-β1、IL-18可能參與腎病綜合征的發展進程。且腎病綜合征患者血清miR-21與細胞因子TGF-β1、IL-18表達均呈正相關，提示二者可能參與調控腎病綜合征的發生發展。另外，該研究中ROC曲線分析表明，血清miR-21診斷腎病綜合征的曲線下面積為0.852，提示血清miR-21可作為評估腎病綜合征發生的指標。Logistic回歸分析結果顯示，血清miR-21、血尿素氮、血肌酐是腎病綜合征發生的影響因素。提示監測三者水平，對臨床評估腎病綜合征發生有一定價值。

綜上所述，miR-21在腎病綜合征患者血清中表達明顯升高，且與疾病發生發展密切相關，具有一定的診斷價值，提示血清miR-21可作為腎病綜合征早期診斷及病情評估的潛在生物學指標。但對其具體的作用機制尚未完全清晰，有待深入研究。