巴曲酶對分泌性中耳炎大鼠炎癥的抑制作用及機制

劉蓓，任良宏

武漢市第六醫院耳鼻喉科，武漢430000

分泌性中耳炎（SOM）是以中耳積液（MEE）及聽力下降為主要特征的咽鼓管機械性阻塞和功能障礙性疾?。?］，常見于兒童。目前對于SOM的病因及發病機制的研究尚未完善，中耳非化膿性炎性病變、咽鼓管感染及免疫功能異常等都被認為與SOM的發病相關［2］。SOM早期癥狀不明顯，常導致誤診，晚期發展為粘連性中耳炎并發聽力減退等；臨床常采用鼓膜置管術等進行治療，保守治療則采用鼻腔收縮劑、抗生素或口服糖皮質激素類藥物［3］。雖然治療方法眾多，但治療過程中患者依從性差，手術風險及藥物不良反應較大。巴曲酶是一類降纖類凝血酶原類似物，提取自中南美洲響尾蛇毒液［4］，其對內皮細胞代謝及細胞因子的表達有調控作用，已被普遍用于急性腦梗死、腦缺血及深靜脈血栓等疾病的治療［5］。近年來巴曲酶也用于突發性耳聾、閉塞性血栓性脈管炎等機體炎癥的治療［6］，但尚未見巴曲酶治療SOM的相關報道。本研究于2019年10月通過建立SOM大鼠模型，探究巴曲酶對SOM大鼠的治療效果及作用機制，旨在為臨床治療SOM提供新思路。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 雄性SD大鼠30只，體質量（150.0±10.0）g，由江漢大學醫學動物實驗中心提供。巴曲酶注射液購自北京托畢西藥業有限公司。本研究獲得本院動物護理和使用委員會批準審核（審批號：20190517-06），嚴格遵守《實驗動物管理條例》，遵循3R原則。內毒素（1 mg/mL，加生理鹽水配置）購自美國Sigma-Aldrich生物公司；生理鹽水購自四川科倫藥業股份有限公司；白細胞介素4（IL-4）、干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯免疫吸附（ELISA）檢測試劑盒購自杭州聯科生物技術股份有限公司；anti-TNF-α及HRP標記的山羊抗兔 IgG 購自 Santa Cruz；TRIzol（Invitrogen）；反轉錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒購自日本TAKARA公司；qRT-PCR所用引物委托通用生物科技有限公司設計并合成。T100型PCR儀購自美國伯樂生命醫學產品公司；酶標儀購自上海寰熙醫療器械有限公司。

1.2 動物分組及模型制備 采用隨機數字表法將大鼠分為對照組、模型組、巴曲酶組，每組10只，分籠飼養。適應性喂養1周，期間檢測大鼠耳廓靈敏反應，顯微鏡下觀察大鼠雙側鼓膜形態結構并排除中耳感染。大鼠SOM模型建立參照文獻［7］，0.4%戊巴比妥鈉完全麻醉大鼠（0.1 ml/10 g），固定大鼠，模型組、巴曲酶組經右側中耳用微量注射器（hamilton 80565）注射200 ng/mL內毒素溶液50μL，對照組給予相同位置等量生理鹽水注射。造模后光學顯微鏡下（×50）觀察大鼠鼓膜混濁內陷、膨出并分泌積液等作為造模成功標準。造模后隔日開始給予巴曲酶組1.0 BU/kg巴曲酶注射液腹腔注射，同時對照組、模型組注射等量生理鹽水，每日1次，共14 d。

1.3 MEE中TNF-α、IFN-γ、IL-4檢測及IFN-γ/IL-4計算 末次給藥后隔日處死大鼠，剝離暴露右耳聽泡，用PBS 50 mL反復沖洗3次，收集灌洗液，3 000 r/min低速離心10 min（離心半徑13.5 cm），收集灌洗液上清，用ELISA法檢測MEE中TNF-α、IFN-γ、IL-4水平，并計算IFN-γ/IL-4。嚴格按照試劑盒說明書進行操作。每組樣本設置8個副本，實驗重復3次。

1.4 中耳黏膜組織病理變化觀察 將聽泡置于濾紙上干燥，于顯微鏡下剝離中耳黏膜組織，加入4%多聚甲醛室溫固定24 h，脫水后浸蠟包埋，上冷凍切片機制得5μm厚度切片。切片經蘇木素-伊紅（HE）染色后置于光學顯微鏡（×100）下觀察中耳黏膜組織病理變化。

1.5 中耳黏膜組織中TNF-α、IFN-γ、IL-4 mRNA表達檢測 采用qRT-PCR。取各組右耳黏膜樣本20 mg，充分剪碎后加入液氮碾磨成粉末，參照TRIzol試劑盒說明書提取組織總RNA。將總RNA逆轉錄合成cDNA，經核酸定量儀檢測cDNA純度及濃度，取cDNA 100 ng用于qRT-PCR擴增。PCR反應條件及參數：預變性95℃5 min；擴增循環95℃1 min，55 ℃ 2 min，72 ℃ 1 min，共40次循環；溶解曲線95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。以GAPDH為內參引物，每組樣品設置3個副本。GAPDH正向引物5′-CTATGACAGAAACCAGACTCA-3′，反向引物5′-CAGCAGATCAAAGGTGCCGA-3′；TNF-α正向引物 5′-CTGCGCATTTTCCGAGAGATAG-3′，反 向 引物 5′-TGAATTCGTTACAGCTGAGCAG-3′；IFN-γ 正向引物 5′-CCACGCACAGGTTGGAAGCA-3′，反向引物5′-GATTGCGATACAGTATCCTCGC-3′；IL-4正向引物 5′-TGTTCTCGAGTCTGGCTATCA-3′，反向引物 5′-CCGTGATGAGGATGCCCTA-3′。用 2-ΔΔCt法計算mRNA表達。

1.6 統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件。正態分布計量資料用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組鼓膜形態及中耳黏膜病理變化 大鼠鼓膜形態結構變化：對照組鼓膜結構清晰、形態正常，未見黏性組織積液分泌，局部呈現規則放射狀血管紋；模型組耳膜腫脹、局部有明顯內陷及組織積液積聚，耳道粘連；巴曲酶組較模型組耳膜腫脹程度明顯減弱，個別大鼠可見積液及氣泡存在，膨出現象顯著減少。大鼠中耳黏膜病理變化：對照組中耳內組織上皮排列規則，纖毛結構正常，黏膜組織無病理變化；模型組中耳內組織上皮明顯腫脹，組織間隙紊亂并伴隨大量炎性細胞浸潤，黏膜下層肥大細胞明顯增多，組織結構異常；巴曲酶組中耳內組織上皮組織形態結構未見明顯改善，組織炎性浸潤較模型組減輕。

2.2 各組MEE中TNF-α、IFN-γ、IL-4水平及IFNγ/IL-4比較 與對照組比較，模型組MEE中TNF-α、IFN-γ、IL-4水平高，IFN-γ/IL-4低（P均＜0.05）。與模型組比較，巴曲酶組MEE中TNF-α水平低、IFN-γ水平及IFN-γ/IL-4高（P均＜0.05）；而兩組MEE中IL-4水平比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組MEE中TNF-α、IFN-γ、IL-4水平比較（-x± s）

2.3 各組中耳黏膜組織中TNF-α、IFN-γ、IL-4 mRNA表達比較 與對照組比較，模型組中耳黏膜組織中TNF-α、IFN-γ、IL-4 mRNA表達高（P均＜0.05）。與模型組比較，巴曲酶組中耳黏膜組織中TNF-αmRNA表達低，IFN-γmRNA表達高（P均＜0.05）；而兩組中耳黏膜組織中IL-4 mRNA表達比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組中耳黏膜組織中TNF-α、IFN-γ、IL-4 mRNA表達比較（-x± s）

3 討論

中耳炎是多種原因引起的中耳全部或部分結構炎癥性病變，臨床主要分為化膿性和非化膿性中耳炎。其中非化膿性中耳炎又分為SOM及氣壓損傷性中耳炎。近年來研究認為，SOM是臨床中常見的導致兒童聽力損傷及語言功能障礙的疾病，同時慢性鼻竇炎等多種機械性阻塞、細菌病毒感染引起的功能性通氣障礙等疾病是SOM發病的主要原因。

近年來越來越多的學者對SOM的病因及發病機制提出了假說，其中“中耳負壓學說”“免疫學說”“Th1/Th2失衡假說”等尤為受到關注［8-10］。相應的，黏蛋白、細胞因子及自身免疫調節等靶向不同機制的治療手段成為現階段治療SOM的研究熱點。而巴曲酶作為一種可能的免疫調節因子對SOM發生過程中的分子調控和炎癥抑制機制未見研究。本研究通過構建大鼠SOM模型，首次探究了其對包括TNF-α在內的細胞因子的調節作用，為闡明巴曲酶治療SOM的機制提供依據。

本研究通過采用中耳注射內毒素溶液法建立分泌性中耳炎大鼠模型，研究巴曲酶對于分泌性中耳炎大鼠的作用及機制。首先通過耳鏡觀察大鼠鼓膜外部形態及組織切片HE染色表征巴曲酶對SOM大鼠的治療作用，結果顯示巴曲酶能夠顯著抑制中耳黏膜組織炎性細胞浸潤、改善模型大鼠耳膜腫脹及組織積液分泌異常等病理變化，同時結果顯示巴曲酶能夠對中耳組織上皮形態結構恢復起到一定的治療作用，提示巴曲酶能夠顯著改善SOM大鼠中耳組織病理改變，抑制組織結構病理性進展，進而發揮對SOM的治療作用。

近年來研究發現，TNF-α參與分泌性中耳炎的疾病進展。李欣等［11］臨床研究表明，TNF-α參與SOM發病及遷延過程，并與MEE的清除有關；曾祥悅等［12］通過研究發現，SOM模型豚鼠耳泡灌洗液TNF-α水平及中耳黏膜TNF-α表達均顯著升高，通過抑制TNF-α表達則能夠減輕黏膜厚度和中性粒細胞浸潤程度，進而改善SOM疾病進展，可見TNF-α在SOM進展及疾病轉歸中發揮著關鍵作用。本研究通過ELISA檢測炎性因子TNF-α表達，結果表明，與對照組比較，模型組MEE及中耳黏膜組織TNF-α表達高；與模型組比較，巴曲酶組MEE及中耳黏膜組織TNF-α表達低。提示巴曲酶能夠通過調控TNF-α表達抑制中耳上皮細胞或成纖維細胞表面黏附分子的表達，調控胞質及組織間隙炎性細胞分泌，發揮對SOM炎癥的抑制作用。

“Th1/Th2失衡假說”認為，Th1和Th2細胞作為CD4+T細胞激活后的兩種效應細胞，二者在機體內的動態平衡共同維系著機體的免疫系統［13］，而IFN-γ和IL-4的表達水平則分別代表著兩種細胞在體內的活化狀態［14］。前期研究表明，中耳在受到各種局部刺激后體內會發生Th細胞的分化偏移［15］，這種偏移會導致黏膜上皮損傷和組織積液產生［16］，進而誘導并加重SOM的發生發展。所以在SOM的治療過程中，對于IFN-γ和IL-4水平的調控是SOM能夠得到有效控制的關鍵。本研究結果顯示，與對照組比較，模型組MEE中IFN-γ、IL-4水平高，而IFN-γ/IL-4卻呈現降低趨勢，給予巴曲酶注射治療后IFN-γ表達持續增加，與模型組存在顯著性差異，IL-4表達趨于穩定，與模型組間無差異。巴曲酶組IFN-γ/IL-4值較模型組顯著升高，同時IFN-γ、IL-4 mRNA的表達變化也與上述檢測結果一致。提示在SOM的發病早期會促進體內IFN-γ的表達，而IFN-γ表達增加則進一步促進了巨噬細胞活化，進而激活細胞免疫應答的發生，但給予SOM大鼠巴曲酶后其組織病理變化緩解的同時IFN-γ水平則進一步升高。這表明早期SOM發病過程中IFN-γ水平的略微升高反而會刺激炎癥進一步加劇，而給予大鼠巴曲酶后能夠促進IFN-γ水平進一步升高至能夠發揮炎癥抑制作用的水平，進而激活機體對炎癥細胞分泌的抑制作用；同時巴曲酶對IL-4分泌的抑制作用則提示巴曲酶可能通過抑制Th2細胞激活介導的Ⅰ型自身免疫反應，進而抑制炎性細胞分泌、浸潤及積聚。

綜上所述，本研究首次證明了巴曲酶對SOM大鼠具有一定的治療作用，其作用機制可能與抑制TNF-α表達并調控IFN-γ/IL-4失衡有關，對SOM的治療有一定的參考意義。