circ_0009910對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響及機(jī)制

何明璇，王鵬，馮娜欣，劉錦燕

保定市第二醫(yī)院腫瘤內(nèi)科血液科，河北保定071051

結(jié)直腸癌是臨床常見惡性腫瘤之一［1-2］。由于其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，患者預(yù)后較差，轉(zhuǎn)移性晚期結(jié)直腸癌患者的5年生存率低至10%［2］。因此，迫切需要發(fā)現(xiàn)新的生物學(xué)標(biāo)志物協(xié)助臨床早期診斷、治療。環(huán)狀RNA（circRNA）是一種特殊的新型內(nèi)源性非編碼RNA，形成共價(jià)閉合的連續(xù)環(huán)，并在真核轉(zhuǎn)錄組中高表達(dá)［3］。circRNA可與微小RNA（miRNA）相互作用［4］。miRNA是一種進(jìn)化保守的小型調(diào)節(jié)性非編碼RNA，參與細(xì)胞增殖、凋亡等多種生物學(xué)過程［5］。研究表明，circ_0009910在急性髓系白血病患者中表達(dá)上調(diào)，敲低其表達(dá)可抑制白血病細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡［6］。circ_0009910在骨肉瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，下調(diào)其表達(dá)抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［7］。miR-198在結(jié)直腸癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)miR-198抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和克隆形成，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［8］。miR-198在胃癌細(xì)胞中低表達(dá)，上調(diào)其表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［9］。我們前期研究證實(shí)，circ_0009910在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，miR-198在結(jié)直腸癌組織中低表達(dá)。但circ_0009910是否通過靶向調(diào)控miR-198影響結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、凋亡，目前還尚未可知。2016—2020年，本研究對此做了探討。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器 結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW620（美國典型培養(yǎng)物保藏中心）。DMEM培養(yǎng)基、FBS、TRIzol試劑、Lipofectamine 2000（美國 Invitrogen公司），miR-198 mimic/inhibitor、對 照 miR-NC、anti-miR-NC（上海Genechem公司），circ_0009910特定siRNA si-circ_0009910、對 照 si-NC、pcDNA-circ_0009910、空載體pcDNA（上海GenePharma公司），Prime Script RT Master Mix試劑盒（日本Takara公司），SYBR Master Mix（美國ABI公司），MTT（上海Bio Basic公司），膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）/碘化丙啶（PI）試劑盒（美國BD Biosciences公司），二辛可寧酸（BCA）蛋白測定試劑盒（美國BioRad公司），BeyoECL試劑盒（上海Beyotime公司）。ABI 7500 PCR儀（美國ABI公司），Multiscan MK3酶標(biāo)儀（美國Thermo Scientific公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及轉(zhuǎn)染 將SW620細(xì)胞在含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，保存在37℃含5%CO2培養(yǎng)箱中。將細(xì)胞按2×105/孔接種在6孔板中，孵育過夜，至融合度達(dá)50%～80%。用Lipofectamine 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將細(xì)胞隨機(jī)分組并進(jìn)行轉(zhuǎn)染，si-NC組轉(zhuǎn)染si-NC、si-circ_0009910組轉(zhuǎn)染sicirc_0009910、pcDNA 組 轉(zhuǎn) 染 pcDNA、pcDNA-circ_0009910組轉(zhuǎn)染pcDNA-circ_0009910、miR-NC組轉(zhuǎn)染 miR-NC、miR-198組轉(zhuǎn)染 miR-198 mimic、si-circ_0009910+anti-miR-NC組共轉(zhuǎn)染si-circ_0009910和anti-miR-NC、si-circ_0009910+anti-miR-198組共轉(zhuǎn)染si-circ_0009910 和 miR-198 inhibitor。轉(zhuǎn)染 48 h，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）法評估轉(zhuǎn)染效率。

1.3 細(xì)胞中circ_0009910、miR-198表達(dá)檢測 采用qRT-PCR。用TRIzol試劑從SW620細(xì)胞中分離總RNA，用Prime Script RT Master Mix將500 ng總RNA反轉(zhuǎn)錄，終體積為10μL。用SYBR Master Mix在ABI 7500系統(tǒng)上進(jìn)行PCR。circ_0009910正向引物 5'-TGAGAGGCATCAGTGAGGTG-3'、反 向 引 物5'-AAGTGCTTAAGTGGGGATGC-3'；miR-198 正 向引物5'-GGTCCAGAGGGGAGAT-3'、反向引物5'-GAATACCTCGGACCCTGC-3'；β肌動蛋白（β-actin）正向引物5'-GGCACTCTTCCAGCCTTCC-3'、反向引物5'-GAGCCGCCGATCCACAC-3'；U6正向引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACATA-3'、反 向 引 物 5'-AACGATTCACGAATTTGCGT-3'。β-actin、U6分別作為circ_0009910、miR-198的內(nèi)參。用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對表達(dá)量。

1.4 細(xì)胞增殖能力檢測 采用MTT法。將各組細(xì)胞鋪在96孔板（2×104/孔，3個(gè)復(fù)孔/組），培養(yǎng)2 d。每孔加入5 mg/mL的MTT，在37℃下反應(yīng)4 h。用二甲基亞砜200μL終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀獲得490 nm處的吸光度（OD）值。

1.5 細(xì)胞凋亡能力檢測 采用Annexin V-FITC/PI雙染法。將各組細(xì)胞鋪在6孔板中（6×105/孔），培養(yǎng)1 d。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后孵育2 d，用冷磷酸鹽緩沖液洗滌2次，用Annexin V-FITC/PI試劑盒染色。根據(jù)說明，使用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.6 細(xì)胞內(nèi)核相關(guān)抗原Ki-67（Ki-67）、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）蛋白、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）表達(dá)檢測 采用Western blotting法。用RIPA裂解緩沖液從SW620細(xì)胞中提取總蛋白，用BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。用SDS-PAGE分離蛋白，然后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上。用5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h后，與Ki-67、Bcl-2、Bax、GAPDH一抗（均1∶1 000稀釋）孵育，4℃過夜。室溫下與辣根過氧化物酶結(jié)合的二抗孵育2 h。用BeyoECL試劑盒對蛋白條帶顯影。用ImageJ軟件通過半定量法分析Ki-67、Bcl-2、Bax蛋白信號。目的蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

1.7 circ_0009910靶基因驗(yàn)證 采用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)。在Circular RNA Interactome（https：//circinteractome.irp.nia.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫中篩選出circ_0009910的潛在靶基因miR-198。合成具有突變（MUT）或野生型（WT）結(jié)合位點(diǎn)的 circRNA_0009910片段，并將其克隆到psiCHECK-2載體中。使用Lipofectamine 2000將SW620細(xì)胞（1×105/孔）與野生型circ_0009910（WT-circ_0009910）或突變型（MUT-circ_0009910）以及miR-198 mimic或miR-NC共轉(zhuǎn)染。誘導(dǎo)2 d后，使用試劑盒檢測熒光素酶活性。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用±s表示，比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 circ_0009910低表達(dá)對SW620細(xì)胞增殖、凋亡及蛋白表達(dá)的影響 與si-NC組比較，si-circ_0009910組細(xì)胞增殖能力低，細(xì)胞凋亡率高，Ki-67、Bcl-2蛋白相對表達(dá)量低，Bax蛋白相對表達(dá)量高（P均＜0.05）。見表1。

表1 si-NC組、si-circ_0009910組細(xì)胞增殖、凋亡率及相關(guān)蛋白表達(dá)比較（±s）

表1 si-NC組、si-circ_0009910組細(xì)胞增殖、凋亡率及相關(guān)蛋白表達(dá)比較（±s）

組別si-NC組si-circ_0009910組t P細(xì)胞增殖（OD值）0.75±0.04 0.32±0.03 25.800＜0.05細(xì)胞凋亡率（%）6.99±0.55 22.31±2.17 20.531＜0.05 Ki-67蛋白0.64±0.03 0.22±0.02 34.946＜0.05 Bcl-2蛋白0.83±0.06 0.34±0.03 21.913＜0.05 Bax蛋白0.13±0.02 0.57±0.04 29.516＜0.05

2.2 circ_0009910靶基因驗(yàn)證結(jié)果 Circular RNA Interactome軟件預(yù)測出circ_0009910的部分堿基序列可與miR-198形成互補(bǔ)配對。與miR-NC組比較，miR-198組轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-circ_0009910后熒光素酶活性低（P＜0.05）；而兩組轉(zhuǎn)染MUT-circ_0009910后熒光素酶活性比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。pcDNA組、pcDNA-circ_0009910組miR-198相對表達(dá)量分別為 1.00±0.07、0.42±0.05，與pcDNA組比較，pcDNA-circ_0009910組miR-198相對表達(dá)量低（P＜0.05）。si-NC組、si-circ_0009910組miR-198相對表達(dá)量分別為1.03±0.07、3.28±0.25，與si-NC組比較，si-circ_0009910組miR-198相對表達(dá)量高（P＜0.05）。

表2 miR-NC組、miR-198組熒光素酶活性比較（±s）

表2 miR-NC組、miR-198組熒光素酶活性比較（±s）

組別miR-NC組miR-198組t P轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-circ_0009910 1.06±0.06 0.53±0.04 22.049＜0.05轉(zhuǎn)染MUT-circ_0009910 1.01±0.06 1.03±0.06 0.707 0.490

2.3 miR-198過表達(dá)對SW620細(xì)胞增殖、凋亡的影響 與miR-NC組比較，miR-198組SW620細(xì)胞增殖能力低，細(xì)胞凋亡率高，Ki-67、Bcl-2蛋白相對表達(dá)量低，Bax蛋白相對表達(dá)量高（P均＜0.05）。見表3。

表3 miR-NC組、miR-198組細(xì)胞增殖、凋亡率及相關(guān)蛋白表達(dá)比較（±s）

表3 miR-NC組、miR-198組細(xì)胞增殖、凋亡率及相關(guān)蛋白表達(dá)比較（±s）

組別miR-NC組miR-198組t P細(xì)胞增殖（OD值）0.77±0.06 0.41±0.03 16.100＜0.05細(xì)胞凋亡率（%）7.18±0.49 19.02±1.50 22.509＜0.05 Ki-67蛋白0.66±0.05 0.29±0.02 20.612＜0.05 Bcl-2蛋白0.84±0.05 0.39±0.03 23.152＜0.05 Bax蛋白0.12±0.02 0.53±0.04 27.504＜0.05

2.4 抑制miR-198表達(dá)對circ_0009910作用的影響 與si-circ_0009910+anti-miR-NC組比較，si-circ_0009910+anti-miR-198組細(xì)胞增殖能力高，細(xì)胞凋亡率低，Ki-67、Bcl-2蛋白相對表達(dá)量高，Bax蛋白相對表達(dá)量低（P均＜0.05）。見表4。

表4 si-circ_0009910+anti-miR-NC、si-circ_0009910+anti-miR-198組細(xì)胞增殖、凋亡率及相關(guān)蛋白表達(dá)比較（±s）

表4 si-circ_0009910+anti-miR-NC、si-circ_0009910+anti-miR-198組細(xì)胞增殖、凋亡率及相關(guān)蛋白表達(dá)比較（±s）

組別si-circ_0009910+anti-miR-NC組si-circ_0009910+anti-miR-198組t P細(xì)胞增殖（OD值）0.30±0.02 0.65±0.05 19.498＜0.05細(xì)胞凋亡率（%）23.31±2.07 10.38±0.69 17.778＜0.05 Ki-67蛋白0.20±0.02 0.55±0.04 23.479＜0.05 Bcl-2蛋白0.33±0.02 0.72±0.04 26.162＜0.05 Bax蛋白0.58±0.05 0.23±0.02 19.498＜0.05

3 討論

circRNA在多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用，可以作為某些疾病診斷或預(yù)測預(yù)后的生物標(biāo)志物［10-11］。因circRNA的豐度和穩(wěn)定性，其比其他RNA更適合作為潛在的診斷或預(yù)測預(yù)癌癥生物標(biāo)志物［12］。然而，大量的circRNA仍未鑒定。前期研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織中circ_0009910高表達(dá)，這與相關(guān)報(bào)道［6-7］相符，但circ_0009910在結(jié)直腸癌中的具體功能和作用機(jī)制尚不明確。研究表明，circ_0009910在胃癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)，敲除circ_0009910表達(dá)可以抑制胃癌BGC823和AGS細(xì)胞的體外增殖、遷移和侵襲［13］。circ_0009910在肝細(xì)胞癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，敲除circ_0009910可顯著抑制HepG2細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并在肝細(xì)胞癌異種移植瘤模型中抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移［14］。為觀察circ_0009910在結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和凋亡中的作用，本研究用siRNA成功下調(diào)SW620細(xì)胞中circ_0009910的表達(dá)。結(jié)果顯示，干擾circ_0009910表達(dá)后，SW620細(xì)胞的增殖、Ki-67蛋白和Bcl-2蛋白的表達(dá)降低，凋亡率和Bax蛋白表達(dá)升高。表明circ_0009910是結(jié)直腸癌的腫瘤啟動子，與相關(guān)報(bào)道［13-14］吻合。

研究顯示，miRNA為腫瘤抑制因子或癌基因［15］。miR-198是一種重要的抑癌因子［16］，在結(jié)直腸癌中低表達(dá)，充當(dāng)腫瘤抑制因子減緩結(jié)直腸癌的進(jìn)展［8］。在結(jié)直腸癌中，miR-198表達(dá)與淋巴結(jié)浸潤、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和患者生存率相關(guān)，miR-198在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的過表達(dá)顯著降低結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長［17］。此外，miR-198在肺腺癌組織中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)其表達(dá)可抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［18］。本研究觀察到miR-198過表達(dá)顯著抑制SW620細(xì)胞增殖、Ki-67蛋白和Bcl-2蛋白表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡、Bax蛋白表達(dá)，與前述報(bào)道［8，17］相同，為miR-198在結(jié)直腸癌中起抑癌作用提供了新的證據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，circ_0009910對miR-198有靶向作用，并且circ_0009910對SW620細(xì)胞中miR-198的表達(dá)具有負(fù)向調(diào)控作用。根據(jù)競爭內(nèi)源性RNA理論，circRNA通過充當(dāng)miRNA海綿來影響相應(yīng)的 miRNA表達(dá)，從而參與腫瘤進(jìn)展［19-20］。circ_0009910通過靶向負(fù)調(diào)控miR-145誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞的增殖性和活動性表型［21］。circ_0009910通過靶向miR-34a-5p調(diào)節(jié)ULK1誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬，提升慢性髓細(xì)胞性白血病細(xì)胞對伊馬替尼的耐藥性［22］。Circ0004390通過海綿化miR-198促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖［23］。本研究抑制miR-198表達(dá)后，circ_0009910對SW620細(xì)胞增殖、凋亡的影響均被逆轉(zhuǎn)。這證實(shí)circ_0009910通過靶向負(fù)調(diào)控miR-198來影響結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖與凋亡。

綜上所述，circ_0009910高表達(dá)可抑制結(jié)直腸癌SW620細(xì)胞增殖，促進(jìn)SW620細(xì)胞凋亡，circ_0009910促癌機(jī)制與負(fù)調(diào)控miR-198的表達(dá)有關(guān)。因此，circ_0009910可能是治療結(jié)直腸癌的潛在靶點(diǎn)。