環狀RNA0026344靶向miR-21對肝癌細胞增殖、遷移、侵襲的影響及機制

尹航，齊小峰，黃欣，蘇群，馬濤

解放軍總醫院海南醫院腫瘤內科，海南三亞572014

肝癌是世界范圍內最常見癌癥之一，具有高發病率和高病死率特點。目前，臨床主要采用肝切除、肝移植等治療方法，但由于術后復發、轉移頻繁，肝癌患者5年生存率仍較低［1］。因此，探討肝癌發病、轉移的具體機制對開發新的治療策略十分必要。環狀RNA（circRNA）是非編碼RNA家族重要成員，其表達異常可影響增殖、凋亡、自噬和轉移等細胞過程，在癌癥中具有致癌驅動因子或腫瘤抑制因子功能［2-4］。研 究 表 明，結 直 腸 癌 組 織 中 circRNA 0026344（circ_0026344）低表達預示患者預后不良，與結直腸癌進展及淋巴結轉移相關；circ_0026344表達升高可抑制結直腸癌細胞生長、侵襲，誘導細胞凋亡［5］。然而circ_0026344在肝癌中的表達、作用尚未見詳細報道。微小RNA-21（miR-21）是一種肝癌致癌因子，其高表達對肝癌細胞具有促增殖、促遷移作用［6］。靶基因預測數據庫分析顯示，miR-21和circ_0026344之間可能存在相互作用，于是推測circ_0026344可能靶向miR-21參與肝癌進展。本研究對此做了探討。

1 材料與方法

1.1 材料 肝癌組織及其癌旁組織：收集2019年1月—12月本院25例肝癌患者切除術中的肝癌組織及其癌旁組織（距離腫瘤邊緣＞3 cm），均未接受術前治療，均經病理檢查確診。所有組織切除后立即在液氮中快速冷凍，于-80℃保存。患者男18例、女7例；年齡在40～73歲，中位年齡60歲；TNM腫瘤分期：Ⅰ期5例，Ⅱ期10例，Ⅲ期6例，Ⅳ期4例。患者均簽訂知情同意書，且本研究獲得醫院醫學倫理委員會批準。人肝癌細胞系HCC9204購自中國科學院上海細胞庫；逆轉錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒購自上海生工生物工程股份有限公司；miR-21模擬物（mimics）及其陰性對照（miR-NC）、miR-21抑制物（anti-miR-21）及其陰性對照（anti-miR-21）、circ_0026344過表達載體（pcDNAcirc_0026344）及空載體質粒（pcDNA）、熒光素酶報告質粒（wt-circ_0026344或mut-circ_0026344）購自廣州銳博生物技術有限公司；噻唑藍（MTT）試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；基質膠和Transwell小室購自北京優尼康生物科技有限公司；兔源上皮細胞鈣黏蛋白（E-cadherin）單克隆抗體、兔源N-cadherin單克隆抗體、兔源甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體、羊抗兔IgG二抗購自美國Santa Cruz。BK-9613型酶標儀購自山東博科儀器有限公司；7500型qRT-PCR儀購自美國ABI公司。

1.2 肝癌組織及癌旁組織中circ_0026344、miR-21表達檢測 采用qRT-PCR。用TRIzol試劑提取肝癌組織、癌旁組織中總RNA，用無RNA的超純水將5μL總RNA樣本稀釋20倍，紫外分光光度法分析260、280 nm處光密度（OD）值以確定RNA的濃度和純度，OD260/OD280值1.7～2.1則為RNA合格，可用于后續實驗。按照逆轉錄試劑盒將總RNA反轉錄成cDNA模板，根據SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒說明書進行qRT-PCR。circ_0026344引物序列：上游5'-CTCAGCCTCTAGCATAAGCTC-3'，下 游 5'-AG-GCAAGAGAATGATTTGAAC-3'；內 參 GAPDH 引 物序列：上游 5'-TTGCCCTCAACGACCACTTT-3'，下游5'-TGGTCCAGGGGTCTTACTCC-3'；miR-21 引 物 序列：上游 5'-TAGCTTATCAGACTGATGTTG-3'，下游5'-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3'；內參 U6引物序列：上游 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游 5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。2-ΔΔCt法計算circ_0026344、miR-21相對表達量。

1.3 細胞培養、轉染及分組 HCC9204細胞接種在含90%DMEM培養基、10%胎牛血清的培養液中，放入含95%空氣、5%CO2、37℃恒溫培養箱培養。細胞80%融合時按照1∶3傳代，每周2次。將細胞按照1×106個/孔接種24孔板，用Lipofectamine 2000試劑將轉染RNA轉入融合度60%的HCC9204細胞。首先將1μL的Lipofectamine 2000與50μL的無血清培養液混合，室溫靜置5 min。將20 pmol的轉染RNA和50μL的無血清培養液混合，室溫靜置5 min。將上述二者混合，室溫靜置20 min得到RNA與脂質體復合物。將混合物加入含有細胞的培養皿中，培養6 h后更換為完全培養基，轉染48 h后按照qRT-PCR法檢測circ_0026344、miR-21表達，轉染成功后進行下一步實驗。根據轉染RNA不同將細胞分為pcDNA組（轉染pcDNA）、pcDNA-circ_0026344組（轉染pcDNA-circ_0026344）、anti-miR-NC組（轉染anti-miR-NC）、anti-miR-21組（轉染 anti-miR-21）、pcDNA-circ_0026344+miR-NC組（轉染pcDNA-circ_0026344+miR-NC）、pcDNA-circ_0026344+miR-21組（轉染pcDNA-circ_0026344+miR-21 mimics）。

1.4 細胞增殖能力檢測 采用MTT法。將各組HCC9204細胞按照5×103/孔接種于96孔板中，48 h后每孔中添加MTT溶液20μL，培養4 h，每孔中加入二甲基亞砜150μL，振蕩10 min至結晶溶液。用酶標儀檢測波長490 nm處吸光度（OD）值。

1.5 細胞克隆形成數檢測 采用平板克隆實驗。將各組HCC9204細胞按照5×102/孔接種于6孔板中，均勻分散后放入細胞培養箱培養，每隔1天觀察細胞1次，約14 d在平板中看到細胞集落時終止培養。用甲醛固定細胞集落15 min，再用吉姆薩染色30 min。顯微鏡下統計大于50個細胞的集落數即為克隆形成數。

1.6 細胞遷移和侵襲能力檢測 采用Transwell實驗。用無血清培養基重懸各組HCC9204細胞調整為5×105/mL的細胞懸液，取200μL加入鋪有基質膠的Transwell小室，將Transwell小室置于含500μL培養基（胎牛血清體積分數為10%）的24孔板下室中進行侵襲實驗。37℃孵育24 h，用棉簽除去膜表面未侵襲細胞和基質膠，用4%甲醇固定膜下表面的侵襲細胞，用0.1%結晶紫染色。在倒置顯微鏡下隨機拍攝5個視野進行細胞計數即為侵襲細胞數量，取均值。細胞遷移實驗與上述實驗同時進行，但采用未鋪有基質膠的Transwell小室。

1.7 細胞內上皮間充質轉化（EMT）相關蛋白（Ecadherin、N-cadherin）表達檢測 采用Western blotting法。用放射免疫沉淀試驗裂解緩沖液處理HCC9204細胞，然后用二喹啉甲酸法測定總蛋白濃度。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離細胞蛋白，用濕轉移法將蛋白條帶轉移到硝酸纖維素膜上。在室溫下用5%脫脂牛奶孵育膜1 h，于4℃下用一抗溶液孵育膜過夜。次日，用PBS、Tween-20溶液（PBST）洗滌3次，室溫下再用稀釋的二抗溶液孵育膜2 h，然后用PBST沖洗3次。將膜置于暗盒內，加入顯影劑進行顯色反應。ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值。蛋白相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

1.8 circ_0026344與miR-21的靶向關系驗證 采用雙熒光素酶報告實驗。按照上述轉染方法將miR-21 mimic或其陰性對照與熒光素酶報告載體wt-circ_0026344或mut-circ_0026344共轉染到HCC9204細胞中，分別為miR-NC和wt-circ_0026344共轉染、miR-21 mimics和wt-circ_0026344共轉染、miR-NC和mut-circ_0026344共轉染、miR-21 mimics和mut-circ_0026344共轉染。轉染48 h后，收集細胞并通過雙熒光素酶報告基因檢測系統檢測相對熒光素酶活性。

1.9 統計學方法 采用SPSS20.0統計軟件。符合正態分布的計量資料用±s表示，兩組比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肝癌組織及癌旁組織中circ_0026344、miR-21表達比較 肝癌組織及癌旁組織中circ_0026344相對表達量分別為0.27±0.07、1.00±0.11，miR-21相對表達量分別為4.29±0.24、1.02±0.13。與癌旁組織比較，肝癌組織中circ_0026344表達低、miR-21表達量高（P均＜0.05）。

2.2 circ_0026344過表達對HCC9204增殖、遷移及侵襲的影響 pcDNA組、pcDNA-circ_0026344組circ_0026344相對表達量分別為1、3.57± 0.11，miR-21相對表達量分別為1、0.23±0.02。與pcDNA組比較，pcDNA-circ_0026344組circ_0026344相對表達量高、miR-21相對表達量低（P均＜0.05），說明轉染成功。與pcDNA組比較，pcDNA-circ_0026344組HCC9204細胞增殖能力、克隆形成數、遷移及侵襲細胞數、N-cadherin蛋白相對表達量低（P均＜0.05），E-cadherin蛋白相對表達量高（P＜0.05）。見表1。

表1 pcDNA組與pcDNA-circ_0026344組細胞增殖、遷移、侵襲能力及E-cadherin、N-cadherin蛋白表達比較（±s）

表1 pcDNA組與pcDNA-circ_0026344組細胞增殖、遷移、侵襲能力及E-cadherin、N-cadherin蛋白表達比較（±s）

組別 細胞增殖（OD值） 克隆形成數（個） 遷移細胞數（個） 侵襲細胞數（個）E-cadherin蛋白N-cadherin蛋白pcDNA組pcDNA-circ_0026344組t P 1.12±0.08 0.58±0.04 10.457＜0.05 119.00±4.90 58.67±2.49 19.012＜0.05 186.67±6.55 85.00±3.24 24.098＜0.05 123.67±3.68 59.33±2.05 26.455＜0.05 0.19±0.02 0.69±0.07 11.896＜0.05 0.81±0.06 0.23±0.02 15.884＜0.05

2.3 circ_0026344與miR-21的靶向關系 Circular RNA Interactome數據庫在線分析顯示，miR-21與circ_0026344存在特異性結合位點。雙熒光素酶報告實驗顯示，miR-NC+wt-circ_0026344、miR-21 mimics+wt-circ_0026344、miR-NC+mut-circ_0026344、miR-21 mimics+mut-circ_0026344共轉染后熒光素酶活性分別為 1.04±0.09、0.23±0.02、1.00±0.07、0.98±0.08。與miR-NC+wt-circ_0026344共轉染比較，miR-21 mimics+wt-circ_0026344共轉染后細胞相對熒光素酶活性低（P＜0.05）；而與miR-NC+mut-circ_0026344共轉染比較，miR-21 mimics+mut-circ_0026344共轉染后細胞相對熒光素酶活性差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.4 抑制miR-21表達對HCC9204增殖、遷移及侵襲的影響 anti-miR-NC組、anti-miR-21組miR-21相對表達量分別為1、0.13±0.01。與anti-miR-NC組比較，anti-miR-21組miR-21相對表達量低（P＜0.05），說明轉染成功。與anti-miR-NC組比較，anti-miR-21組HCC9204增殖能力、克隆形成數、遷移和侵襲細胞數、N-cadherin蛋白相對表達量低（P均＜0.05），E-cadherin蛋白相對表達量高（P＜0.05）。見表2。

表2 anti-miR-NC組與anti-miR-21組細胞增殖、遷移、侵襲能力及E-cadherin、N-cadherin蛋白表達比較（±s）

表2 anti-miR-NC組與anti-miR-21組細胞增殖、遷移、侵襲能力及E-cadherin、N-cadherin蛋白表達比較（±s）

組別anti-miR-NC組anti-miR-21組t P細胞增殖（OD值）1.13±0.06 0.52±0.03 15.750＜0.05克隆形成數（個）119.67±5.79 48.00±1.63 20.638＜0.05遷移細胞數（個）185.33±8.38 72.00±2.94 22.103＜0.05侵襲細胞數（個）123.33±3.86 53.00±2.16 27.540＜0.05 E-cadherin 0.20±0.02 0.76±0.06 15.336＜0.05 N-cadherin 0.81±0.07 0.13±0.01 16.657＜0.05

2.5 過表達miR-21對circ_0026344作用的影響 pcDNA-circ_0026344+miR-NC組、pcDNA-circ_0026344+miR-21組相對表達量分別為0.23±0.01、0.86±0.06。與pcDNA-circ_0026344+miR-NC組比較，pcDNA-circ_0026344+miR-21組相對表達量高（P＜0.05），說明轉染成功。與pcDNA-circ_0026344+miRNC組比較，pcDNA-circ_0026344+miR-21組增殖能力、克隆形成數、遷移和侵襲細胞數、N-cadherin蛋白相對表達量高（P均＜0.05），E-cadherin蛋白相對表達量低（P＜0.05）。見表3。

表3 pcDNA-circ_0026344+miR-NC組與pcDNA-circ_0026344+miR-21組細胞增殖、遷移、侵襲能力及E-cadherin、N-cadherin蛋白表達比較（-x± s）

3 討論

肝癌的發展是一個多步驟的過程，涉及多種遺傳和表觀遺傳學改變。目前已有多項研究證實circRNA表達改變與肝癌進程相關。YU等［7］研究表明，hsa_circ_0001445表達下調與肝癌侵襲性顯著相關，是肝切除術后患者總生存率和無復發生存率的獨立危險因素，過表達hsa_circ_0001445對肝癌細胞的增殖和遷移具有抑制作用。ZHAN等［8］研究發現，敲低circRNA_103809顯著抑制肝癌細胞增殖、周期進展和遷移。因此，恢復肝癌相關circRNA表達對肝癌進展可能具有抑制作用。本研究發現，肝癌組織中circ_0026344表達顯著降低，提示circ_0026344表達改變可能與肝癌進展相關。過表達circ_0026344顯著降低肝癌細胞HCC9204的活力和克隆形成能力，提示circ_0026344在肝癌中具有抗增殖作用。EMT在癌癥轉移中起著重要作用，以Ecadherin蛋白表達丟失、N-cadherin蛋白表達異常增加為特征［9］。本研究表明，過表達circ_0026344顯著增加E-cadherin蛋白表達，降低N-cadherin蛋白表達，抑制細胞遷移和侵襲。提示circ_0026344可能通過調控EMT抑制HCC9204遷移和侵襲，具有抑癌作用。已有研究顯示，胃癌、結直腸癌中circ_0026344表達降低，過表達circ_0026344顯著抑制結直腸癌細胞遷移、侵襲和EMT進程，與本研究結果一致［10-11］。以上研究證實circ_0026344在肝癌中發揮腫瘤抑制因子作用。

miRNA是內源性非編碼小RNA，其由約22個核苷酸組成，是癌癥中必不可少的表觀遺傳調控因子。多項研究表明，circRNA可以直接與miRNA相互作用以調節靶基因的表達，參與肝癌的進展［12］。如circMAT2B在缺氧條件下通過調控miR-338-3p/PKM2軸促進肝癌細胞糖酵解，從而促進肝癌進展［13］。miR-21參與細胞增殖、血管生成、侵襲和轉移，以及化療和放療耐藥性等細胞過程，是乳腺癌、非小細胞肺癌的致癌因子［14］。在肝癌中miR-21高表達與肝癌患者5年總生存期和5年無病生存期縮短相關，是肝癌潛在預后標志物［15］。本研究證實miR-21與circ_0026344直接特異性結合，且miR-21的表達受circ_0026344負性調控。分析miR-21功能顯示，抑制miR-21表達顯著下調N-cadherin蛋白表達，上調E-cadherin蛋白表達，抑制HCC9204細胞增殖、遷移和侵襲。恢復實驗表明，過表達miR-21顯著減弱circ_0026344過表達對HCC9204細胞增殖、遷移和侵襲的影響，這間接證實circ_0026344在肝癌中的抑癌功能是通過靶向負調控miR-21表達實現的。

綜上所述，肝癌組織中circ_0026344表達降低。過表達circ_0026344可降低肝癌細胞增殖、遷移和侵襲能力，其機制與負調控miR-21表達相關。這為了解circRNA/miRNA調控網路在肝癌中的作用提供了新的線索，為肝癌治療提供了有價值的靶點。