基于網絡藥理學的當歸芍藥散治療抑郁癥的作用機制

孫秋，譚焮，張洪財，付新

1黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院外科教研室，哈爾濱150040；2重慶醫科大學藥學院；3黑龍江中醫藥大學中醫藥研究院；4黑龍江中醫藥大學科技處

抑郁癥是一種常見的精神疾病，發病機制復雜，可由多種因素引起，一般表現為單次或多次的抑郁發作，主要表現為心情低落、思維緩慢、意志活動退化、認知功能障礙等，嚴重影響患者自主生活能力和身心健康［1］。藥物治療抑郁癥存在治愈率低、復發率高等問題。中醫中郁證是指氣、血等其他的生命物質在體內通行不暢，甚至停滯在體內形成有形之實邪的一類疾病。關于郁證的辨證論治主要有六郁辨治、七情辨治以及其他治法。歷代醫家認為，郁證的病因和發病機制多為邪氣阻滯、情志內傷、正氣虛弱等。當歸芍藥散來自《金匱要略》，復方由當歸、芍藥等組成，主治“婦人懷孕、腹痛”及“婦人腹中諸疾痛”。后世醫家在臨床應用過程中，不斷擴展其治療范圍。研究證實，當歸芍藥散對抑郁癥具有改善作用［2］。網絡藥理學以生物學理論為基礎，對生物系統進行網絡分析，選擇相應的信號節點進行多靶點藥物分子分析的新學科。中醫學理論體系與網絡藥理學的整體系統性相吻合。本研究用網絡藥理學的方法探討當歸芍藥散治療抑郁癥的可能機制。

1 資料與方法

1.1 當歸芍藥散化學成分收集 采用中藥系統藥理學分析平臺 TCMSP（http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/index.php），以“當歸”“白芍”“白術”“澤瀉”“川芎”“茯苓”為關鍵詞檢索2012—2020年該平臺當歸芍藥散組方的化學成分。

1.2 當歸芍藥散活性成分及潛在作用靶點篩選采用TCMSP數據平臺，選取同時滿足生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18的化學成分，確定當歸芍藥散的有效活性成分。用TTD和PharmGkb數據庫查找目標化合物的潛在作用靶標。

1.3 抑郁癥相關基因靶點篩選 采用在線人類孟德爾遺傳數據庫（OMIM，http：//omim.org/）、PharmGkb（https：//geneticassociationdb.nih.gov/）數 據庫，以“Depression”為關鍵詞檢索，并以Relevance score為參考，篩選并確定抑郁癥相關的基因靶點。

1.4 核心靶蛋白作用網絡構建 在STRING平臺中導入靶蛋白，設置物種為人類，作用閾值設置為中等，其他默認設置，并構建蛋白互作（PPI）模型。結果導為TSV格式并導入Cytoscape 3.8.0軟件，再利用Network Analysis功能進行拓撲分析，根據拓撲參數，獲得當歸芍藥散作用的關鍵靶蛋白。

1.5 活性成分—靶點網絡構建 所獲得的潛在作用靶點，利用Cytoscape3.8.0軟件構建活性成分—靶點相互作用網絡。分別以疾病、藥物、潛在作用靶點、活性成分為節點，四者相互關系為邊。

1.6 靶點生物過程及代謝通路分析 將得到的藥物潛在抗抑郁靶點導入David數據庫，物種限定為人類，保存結果以P＜0.05為標準篩選其抗抑郁生物過程及代謝通路。采用FunRich軟件進行基因本體（GO）生物學過程富集分析、京都基因與基因組百科全書（KEGG）代謝通路富集分析。分析當歸芍藥散可能的抗抑郁分子作用機制。

1.7 分子對接 取拓撲分析時度值比較高的當歸芍藥散核心活性成分和關鍵靶點，用AutoDock 4.2.6軟件進行分子對接實驗，驗證其相互作用活性。方法：登錄pubchem網頁，下載保存核心活性成分3D結構式，存為sdf格式，再用OpenBabel3.1.1軟件轉化為mol 2格式。用AutoDock Tools將分子結構分別加氫原子、平衡電荷、能量最小化最后存為PDBQT格式。在PDB網頁下載關鍵靶點蛋白的晶體結構，存為pdb格式，用PyMol分離其配體，去水存為pdb格式，AutoDock Tools加氫，計算電荷后存為PDBQT格式。調整對接盒子的大小和格點中心，進行分子對接，并對對接結果進行分析。

2 結果

2.1 當歸芍藥散有效活性成分 當歸芍藥散的潛在活性成分：川芎7個、茯苓15個、當歸2個、白芍13個、白術7個、澤瀉10個。部分結果見表1。

2.2 靶點識別 利用數據庫得到的藥物靶點與OMIM、PharmGkb數據庫得到的抑郁癥相關潛在基因靶點進行配對，共有44個潛在抗抑郁癥作用基因靶點。將有效成分與疾病靶點輸入cytoscape得到化合物—靶點網絡圖。將44個當歸芍藥散—抑郁癥潛在作用基因靶點導入STRING數據庫，獲得涵蓋43個節點、184條邊的網絡圖。該網絡的平均介數為0.569、平均度值為8.56，高于二者平均值的有19 個 ，分 別 為 ACHE、CAT、SLC6A4、TNF、F2、HTR2A、CASP3、MAOA、PPARG、AR、MAPK14、VCAM1、CASP8、JUN、ESR1、CASP9、TGFB1、NOS2、FKBP5。

2.3 當歸芍藥散—成分—抑郁癥—靶點網絡圖將表1中的當歸芍藥散—潛在抑郁癥作用靶點對應的54個活性成分與44個當歸芍藥散—抑郁癥潛在作用靶點輸入Cytoscape3.8.0軟件，構建“當歸芍藥散—成分—抑郁癥—靶點網絡”，經過分析可知網絡圖中共有161個節點，272條邊。節點為靶點基因對應的蛋白質，邊代表蛋白質間的相互作用關系。結果顯示，網絡顯示活性成分類的節點有5個具有高度值。化合物MOL000358（beta-sitosterol）度值=54，來自當歸；MOL000422（kaempferol）度值=43，來自白芍 ；MOL000359（sitosterol）度 值 =32，來 自 白 芍；MOL000449（Stigmasterol）度 值 =28，來 自 當 歸 ；MOL002135（Myricanone）度值=22，來自川芎。靶點類的節點中有11個具有高度值：SLC6A2、PTGS2、GSK3B、HSP90、NCOA2、PTGS1、CHRM1、ADRA1B、GRLF1、P190A、RXRA。

表1 當歸芍藥散候選活性成分及其藥動學參數

2.4 GO生物學過程富集分析結果 將候選靶基因輸入DAVID數據庫，利用GO功能富集分析，得到GO條目249個，其中P＜0.05共234條，生物過程（BP）175條，細胞組成（CC）30條，分子功能（MF）29條。對每個模塊前10位條目進行可視化分析。生物學過程相關性大的條目為能量途徑、代謝、信號轉導、細胞通訊、細胞凋亡等；細胞組成相關性大的條目為細胞質膜、細胞表面、細胞外間隙、質膜整體組分、細胞質等；分子功能相關性大的條目為G蛋白耦合受體活性、外切外配體門控離子通道活動、半胱氨酸類型肽酶活動等。

2.5 KEGG代謝通路富集分析結果 通過KEGG代謝通路富集分析共得到64條通路，且此64條通路P＜0.05。排名前五的通路：AP-1轉錄因子網絡、IL-1介導的信號事件、BMP受體信號轉導、ALK1途徑、ALK1信號事件。

2.6 分子對接結果 當歸芍藥散抗抑郁潛在活性成分中，betasitosterol、Myricanone、Paeoniflorin、stigmasterol的成分度值較高，同時 PTGS2、NCOA2、CHRM1、ADRA1B、GRLF1、HSP90靶點度值連接數排列靠前。分子對接實驗結果見表2。表明betasitosterol等活性成分與PTGS2等關鍵靶點具有良好的結合力。

表2 分子對接結果

3 討論

研究顯示，當歸芍藥散能夠改善記憶損傷和認知功能障礙，可用于治療神經退行性疾病［3］。方中重用芍藥斂肝、和營、止痛，佐以歸、芎以調肝和血，更配以茯苓、白術、澤瀉健脾滲濕，共奏調肝脾、理氣血、利水濕之效。本文通過網絡藥理學的研究方法分析當歸芍藥散治療抑郁癥的作用機制。

本研究共篩選出5個與抑郁癥有關的當歸芍藥散的重要活性成分。kaempferol可抑制神經元凋亡并促進其再生［4］；beta-sitosterol可顯著縮短抑郁小鼠在強迫游泳實驗中的不動時間，其機制可能是通過增加5-羥色胺（5-HT）和去甲腎上腺素（NE）在中樞神經系統中的含量［5］。NE轉運體在嚴重抑郁障礙和驚恐障礙患者中功能降低，NE激動受體不足時會導致憂郁。值得注意的是kaempferol、beta-sitosterol來自當歸芍藥散的君藥當歸、白芍。這與中醫的君臣佐使理論相符合，突出了當歸白芍的君藥作用。此外，其他重要活性成分來自其他各味中藥，這表明當歸芍藥散多種成分協同抗抑郁。根據PPI網絡圖拓撲屬性分析結果顯示，SLC6A4、SLC6A2、PTGS2、NCOA2、PTGS1、CHRM1、ADRA1B、GSTT1、GRLF1、P190A、FKBP5、HSP90度值連接次數均在15以上，推測當歸芍藥散可能通過調控以上基因靶點發揮抗抑郁作用。

已有研究證實，5-HT信號傳導中斷是抑郁癥的特征之一。所以SLC6A4重新攝取5-HT的作用成為研究治療抑郁癥方法的主要內容。研究表明，SLC6A4甲基化與抑郁癥之間存在基因型依賴性關聯；SLC6A4基因變異體（5-HTTLPR、rs 140700、rs 4251417、rs 6354、rs 25528、rs 25531）與幾個CpG位點的DNA甲基化之間存在明顯的相關性，但DNA甲基化僅在特定基因型存在時與抑郁狀態有關；在短5-HTTLPR和5-HTTLPR/r 25531等位基因純合個體中，兩個基因座甲基化降低與抑郁相關［6］。SLC6A2基因轉錄沉默可能是導致與DNA序列無關的網絡功能障礙的另一種機制［7］。抑郁癥也屬炎癥性疾病，PTGS2可通過降低神經炎癥反應來發揮抗抑郁作用［8］。GSK3B活性增高是抑郁癥和雙相情感障礙患者主要情感發作的標志。通常老年抑郁癥患者GSK3B活性較高［9］。MAOA/MAOB是研究精神障礙中DNA甲基化作用的主要候選酶，其在單胺類代謝中起關鍵作用，也是強效抗抑郁藥物如三嗪、苯乙嗪或莫氯貝胺的藥理靶點。MAOA甲基化參與精神疾病的治療反應，并作為治療抑郁癥的潛在機制［10］。GSTT1、GSTM1基因多態性與長期接觸含硫天然氣的個體抑郁有關。長期接觸天然酸性氣體的個體，其基因多態性可能與腦組織DNA鏈斷裂和凋亡呈正相關，尤其是GSTT1缺失基因型者［11］。

FKBP5編碼的FKBP51蛋白，是一種熱休克蛋白（Hsp90）的共伴侶，是情感障礙發生的危險因素。FKBP5與Hsp90協同作用通過短的負反饋回路，從而調節糖皮質激素受體（GR）的活性。這種信號通路在應激后迅速恢復下丘腦—垂體—腎上腺軸的穩態。隨患者年齡增加FKBP51表達增強，其DNA甲基化程度降低。高表達的FKBP51與GR抵抗和減少壓力應對行為有關。此外，FKBP5基因表達與焦慮、抑郁和創傷后應激障礙等情感障礙的發病有關［12］。

當歸芍藥散的活性成分可下調miR-124表達，上調絲裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）和谷氨酸受體亞單位3（Gria3）表達，還能促進海馬突觸的形成。開放式礦場試驗、蔗糖消耗試驗和強迫游泳試驗常用來評價小鼠抑郁樣行為。用當歸芍藥散灌胃后，小鼠蔗糖消耗量增加，抑郁樣行為明顯減少［13］。證實，當歸芍藥散通過下調miR-124表達、調節MAPK14和Gria3信號通路而發揮抗抑郁作用，進而證明當歸芍藥散在治療抑郁癥時多靶點、多通路的特點。

為研究當歸芍藥散對應的關鍵靶點在基因功能和信號通路中的作用，對候選靶點進行GO生物學過程及KEGG代謝通路富集分析。GO分析結果可知當歸芍藥散治療抑郁癥主要涉及的能量途徑細胞凋亡、細胞質膜、細胞外間隙、質膜整體組分、G蛋白耦合受體活性、外切外配體門控離子通道活動、半胱氨酸類型肽酶活動等生物過程。KEGG通路富集結果可見，其參與調控64條通路。研究表明，抑郁樣小鼠從獎賞中獲得積極情緒的主要神經遞質來源是多巴胺能神經元，而受損的神經元和突觸活性可能導致抑郁樣行為［14］。由此推測，當歸芍藥散可能通過神經活動配體—受體相關ACHE、CAT、SLC6A4、TNF、F2、HTR2A、CASP3、MAOA靶點及多巴胺能神經突觸相關靶點，綜合發揮防治抑郁癥的作用。另外，本研究亦發現，抑制細胞凋亡可能是當歸芍藥散的潛在治療途徑。細胞調亡是神經元丟失的主要形式之一，也是抑郁癥的重要病理變化。有研究表明，Aβ蛋白會誘導大腦神經元的凋亡，加重腦損傷［15］。近年來的研究顯示，當歸芍藥散的活性成分可以通過減少細胞凋亡發揮抗抑郁作用。

綜上所述，網絡藥理學方法結合綜合研究和系統評價，符合中醫辨證論治的整體觀和治療特點。當歸芍藥散抗抑郁治療特點為多成分、多靶點、相互交互作用，初步說明當歸芍藥散活性成分的基本藥理作用機制。但本研究也存在缺陷，如用藥代動力學參數篩選藥味活性成分時，可能剔除某些藥味的主成分，導致活性成分篩選不充分。后期仍需對現已發掘的藥物活性成分進行藥效學研究，為中醫藥治療抑郁癥開拓新思路。