阿昔莫司對2型糖尿病合并高脂血癥大鼠肝臟脂質(zhì)代謝及炎癥反應(yīng)的影響

姜愛雯，杜佩珊，石金錚，湯建華，李方江

1河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，張家口075000；2張家口市第一醫(yī)院心血管內(nèi)科

2型糖尿病和血脂異常患者可發(fā)展為非酒精性脂肪肝（NAFLD）［1-2］。當(dāng)儲存脂肪的細(xì)胞達(dá)到極限，機(jī)體內(nèi)的循環(huán)游離脂肪酸和非高密度脂蛋白膽固醇在肝臟堆積［3-4］，發(fā)生脂質(zhì)積聚與肝臟胰島素抵抗［5-6］。NAFLD的發(fā)生與氧化應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)［7］。非酒精性脂肪性肝炎（NASH）患者肝臟硝基酪氨酸水平和異丙醇水平顯著升高，而肝臟脂質(zhì)代謝紊亂是誘發(fā)肝臟氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵［8-9］。阿昔莫司是脂質(zhì)分解抑制劑，可顯著降低血清游離脂肪酸水平，被廣泛用于治療高脂血癥。糖尿病合并的肝臟病變屬于代謝綜合征。研究發(fā)現(xiàn)，阿昔莫司可改善2型糖尿病患者β細(xì)胞功能及組織對胰島素的敏感性，其作用機(jī)制在于抑制游離脂肪酸對胰島素抵抗的誘導(dǎo)作用［10-11］。但目前阿昔莫司在2型糖尿病誘發(fā)的肝臟脂質(zhì)代謝紊亂中的作用鮮見報道。2020年2月—10月，本研究觀察了阿昔莫司對2型糖尿病合并高脂血癥大鼠肝臟脂質(zhì)代謝及炎癥反應(yīng)的改善效果?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 8周齡雄性Goto-Kakizaki（非肥胖型2型糖尿病）大鼠50只，體質(zhì)量180～220 g，雌雄各半，購自河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，合格證號811284，生產(chǎn)許可證號SYXK（冀）2018-008，標(biāo)準(zhǔn)飲食，動物實驗過程按照河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院動物倫理委員會規(guī)定執(zhí)行。阿昔莫司購自西格瑪奧德里奇（Sigma）公司，甘油三酯、膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，CRP、TNF-α、IL-6、脂聯(lián)素檢測試劑盒購自碧云天生物科技有限公司。三諾安穩(wěn)型血糖儀購自中國三諾生物傳感股份有限公司，TecanM200preo酶標(biāo)儀購自瑞士Tecan公司。

1.2 動物分組及模型構(gòu)建 模型建立方法參照文獻(xiàn)［12］。將大鼠隨機(jī)分為5組，每組10只。正常對照組給予正常飲食，其余組給予高脂飲食（豬油18%、蔗糖20%、蛋黃3%、基礎(chǔ)飼料59%），8周后低、中、高劑量組分別給予阿昔莫司灌胃，每天1.5、3、10 mg/kg；正常對照組及模型組給予同體積生理鹽水灌胃。各組均干預(yù)2周。

1.3 體質(zhì)量、肝臟占體質(zhì)量比例及食物消耗量統(tǒng)計 造模同時每日18：00時記錄大鼠食物消耗量；藥物干預(yù)完成后將大鼠稱重，經(jīng)腹腔注射戊巴比妥鈉100～150 mg/kg，處死大鼠，取肝臟并稱重，計算肝臟占體質(zhì)量的比例。

1.4 血糖相關(guān)指標(biāo)檢測 各組于末次給藥后禁食12 h進(jìn)行葡萄糖耐量試驗。各組經(jīng)腹腔注射葡萄糖（2 g/kg），注射前后分別斷尾采血檢測血糖，測空腹血糖（FPG）、空腹胰島素（Fins）及葡萄糖負(fù)荷后30、60、90、120 min血糖，葡萄糖負(fù)荷后60 min血糖為其糖耐量值。用胰島素敏感指數(shù)表示胰島素敏感性，胰島素敏感指數(shù)為葡萄糖負(fù)荷后3～15 min血糖下降速率。用穩(wěn)態(tài)模型計算胰 島素 抵 抗指 數(shù)（HOMA-IR），HOMA-IR=Fins×FPG/22.5。

1.5 血清及肝組織脂質(zhì)檢測 將血液標(biāo)本在3 000 r/min（離心半徑40 mm）、4℃離心15 min，將上清液于-80℃儲存。將1.25 g肝組織在氯仿/甲醇（2∶1）溶液7.5 mL中勻漿，渦旋15 min，加入氯仿、水各2.5 mL，3 000 r/min離心（離心半徑3.15 cm）、4℃下離心20 min，收集氯仿相，樣品在55℃氮氣下?lián)]發(fā)至干。用試劑盒檢測血清TG、TC、HDL-C、游離脂肪酸及肝組織TG、TC。

1.6 肝組織中炎癥因子及脂聯(lián)素檢測 將肝組織在25 mmol Tris-HCl緩沖液中勻漿，含100 mmol Na-Cl、1 mmol乙二胺四乙酸酸、1 mmol乙二醇四乙酸酸、1%Triton-X-100、10 mmol苯甲磺酰氟、蛋白酶抑制劑，pH=7.4。勻漿液在14 000 r/min（離心半徑40 mm）、4℃離心20 min，收集上清液-80℃保存待測。用 ELISA法檢測CRP、TNF-α、IL-6，用 ELISAPhoenix法檢測肝組織脂聯(lián)素。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析方法，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組體質(zhì)量、肝臟占體質(zhì)量比例及食物消耗量比較 見表1。

表1 各組體質(zhì)量、肝臟占體質(zhì)量比例及食物消耗量比較（±s）

表1 各組體質(zhì)量、肝臟占體質(zhì)量比例及食物消耗量比較（±s）

注：與正常對照組比較，a P＜0.05；與模型組比較，b P＜0.05。

組別正常對照組模型組低劑量組中劑量組高劑量組n 10 10 10 10 10體質(zhì)量（g）312± 8 401±27a 389±24 396±25 384±19肝臟占體質(zhì)量比例（%）3.84±0.18 4.67±0.24a 4.41±0.21 4.14±0.18b 4.02±0.19b食物消耗量（g/d）17±2 18±2 16±1 20±2 16±3

2.2 各組血糖相關(guān)指標(biāo)比較 見表2。

表2 各組血糖相關(guān)指標(biāo)比較（±s）

表2 各組血糖相關(guān)指標(biāo)比較（±s）

注：與正常對照組比較，a P＜0.05；與模型組比較，b P＜0.05。

組別正常對照組模型組低劑量組中劑量組高劑量組n 10 10 10 10 10 FPG（mmol/L）5.1±0.3 8.4±0.5a 8.2±0.3 7.6±0.3b 6.7±0.5b糖耐量值（mmol/L）17.1±0.5 20.1±1.2a 20.6±0.8 19.7±0.6 18.3±1.1b胰島素敏感指數(shù)0.28±0.01 0.26±0.01a 0.26±0.02 0.26±0.01 0.29±0.05b HOMA-IR 8.9±0.5 13.6±1.6a 11.9±1.2 11.2±1.2b 10.2±1.2b

2.3 各組血清及肝組織脂質(zhì)水平比較 見表3。

表3 各組血清及肝組織脂質(zhì)水平比較（±s）

表3 各組血清及肝組織脂質(zhì)水平比較（±s）

注：與正常對照組比較，a P＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05。

組別正常對照組模型組低劑量組中劑量組高劑量組n 10 10 10 10 10血清TC（g/L）76.4±4.6 98.4±6.7a 94.1±4.8 89.1±5.9 84.2±3.2b TG（g/L）121.4± 8.9 187.6±16.4a 178.5±11.7 160.4±13.3 147.4±10.1b HDL-C（g/L）67.4±3.7 41.3±1.8a 44.8±2.2 50.1±3.4b 59.4±2.7b游離脂肪酸（mmol/L）0.65±0.07 1.04±0.09a 0.91±0.06 0.84±0.07b 0.76±0.04b肝組織TC（mg/g）3.27±0.64 9.77±0.83a 9.18±0.66 8.01±0.43b 6.75±0.57b TG（mg/g）1.73±0.14 5.64±0.42a 5.07±0.39 4.67±0.37b 3.84±0.31b

2.4 肝組織中炎癥因子及脂聯(lián)素水平比較 見表4。

表4 肝組織中炎癥因子及脂聯(lián)素水平比較（±s）

表4 肝組織中炎癥因子及脂聯(lián)素水平比較（±s）

注：與正常對照組比較，a P＜0.05；與模型組比較，b P＜0.05。

組別正常對照組模型組低劑量組中劑量組高劑量組n 10 10 10 10 10 CRP（μg/mL）26.1±2.7 42.6±7.1a 39.7±6.1 34.5±6.2 32.4±4.1b TNF-α（mg/g）2.78±0.34 4.87±0.51a 4.51±0.42 4.07±0.30b 3.66±0.27b IL-6（mg/g）11.1±1.22 23.7±4.15a 24.1±5.08 17.5±3.14b 15.07±3.33b脂聯(lián)素（μg/mL）4.11±0.24 5.34±0.38a 5.10±0.22 4.81±0.17b 4.64±0.21b

3 討論

隨著肥胖的流行，NAFLD已成為常見的慢性肝病之一。盡管大多數(shù)NAFLD患者無癥狀，但可發(fā)展為NASH，這是肝硬化、終末期肝病和肝細(xì)胞癌的易感狀態(tài)［13-14］。而高脂血癥及2型糖尿病等慢性代謝性疾病與NAFLD的發(fā)生有關(guān)，導(dǎo)致肝脂肪變性和肝損傷［15］。高脂血癥主要由機(jī)體脂質(zhì)代謝異常引起［16-17］。糖尿病可引起機(jī)體糖代謝異常繼而導(dǎo)致機(jī)體能量代謝異常，引起代謝綜合征的發(fā)生。因此，高脂血癥及2型糖尿病已成為一種全球性的健康問題，不僅給個人健康，也給整個社會帶來負(fù)擔(dān)［18］。

阿昔莫司是煙酸類似物，是一種有效的脂質(zhì)分解抑制劑，治療血脂異常有效，可用于治療家族性高膽固醇血癥和2型糖尿?。?9］。在非肥胖的2型糖尿病患者中，阿昔莫司能改善血脂和胰島素的作用。阿昔莫司可使循環(huán)中游離脂肪酸減少，進(jìn)而改善胰島素敏感性［20］。但目前阿昔莫司對2型糖尿病合并高脂血癥患者肝臟脂質(zhì)代謝功能的作用未知。因此，本研究用高脂飼料喂養(yǎng)Goto-Kakizaki大鼠，建立高脂血癥模型［21］。模型大鼠體質(zhì)量顯著升高，且肝占體質(zhì)量比例顯著升高。高脂飲食可導(dǎo)致肥胖，而肥胖是內(nèi)臟脂肪堆積的主要原因；高脂飲食使機(jī)體內(nèi)游離脂肪酸升高，繼而引起脂質(zhì)堆積［22-23］。而阿昔莫司可減少游離脂肪酸的含量，本研究結(jié)果也表明阿昔莫司可顯著降低肝占體質(zhì)量比例及肝組織脂質(zhì)堆積。同時對大鼠血脂及肝組織脂質(zhì)含量的檢測結(jié)果也表明，阿昔莫司可明顯降低血清及肝組織脂質(zhì)水平，同時可明顯升高高密度脂蛋白膽固醇水平，發(fā)揮保護(hù)作用。血糖是導(dǎo)致機(jī)體代謝紊亂的又一誘發(fā)因素。本研究發(fā)現(xiàn)，阿昔莫司能降低大鼠FPG，改善大鼠胰島素抵抗，增加胰島素敏感性。2型糖尿病合并高脂血癥可引起機(jī)體炎性及脂質(zhì)代謝紊亂。阿昔莫司可明顯降低模型大鼠CRP、TNF-α及IL-6水平。脂聯(lián)素是脂肪細(xì)胞分泌的具有生物活性的一類蛋白質(zhì)因子，是脂肪組織基因表達(dá)最豐富的蛋白質(zhì)產(chǎn)物之一。阿昔莫司能改善肝臟脂聯(lián)素代謝紊亂，說明阿昔莫司可明顯改善2型糖尿病合并高脂血癥引起的肝組織損傷。

綜上所述，阿昔莫司可改善2型糖尿病合并高脂血癥大鼠肝組織脂質(zhì)代謝，減輕炎癥反應(yīng)。因此阿昔莫司可能是臨床治療該類疾病的潛在藥物，但其發(fā)揮作用的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步闡明。