丙泊酚對胃癌細胞惡性生物學行為的影響及機制

祁占花，張建業，楊世榮

1青海省交通醫院麻醉科，西寧810000；2青海省交通醫院普外科；3青海省第五人民醫院腫瘤內科

胃癌是臨床常見的消化道惡性腫瘤，特指產生于胃黏膜上皮的惡性腫瘤。胃癌在全球范圍內的發病率和病死率均較高［1-2］。我國胃癌的發病率顯著高于世界平均水平；且隨我國老齡化進程的加快，胃癌發病率還將持續增長［3］。因此，尋找有效治療方法具有重要意義，而目前手術仍是胃癌治療的常見手段，但術后易發生腫瘤擴散、遷移等，患者病死率仍較高［4-6］。近年來有研究顯示，丙泊酚作為一種麻醉藥物，常被用于各類惡性腫瘤手術。丙泊酚能夠抑制乳腺癌、肝癌、食管癌細胞的侵襲和遷移［7-9］，且這一過程可能通過調控細胞外信號調節激酶（ERK）/血管內皮生長因子（VEGF）信號通路實現的。2019年6月—2020年8月，本研究主要基于ERK/VEGF信號通路探討丙泊酚對胃癌細胞增殖、侵襲及遷移的影響，為胃癌的臨床治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 細胞、材料及儀器 人胃癌細胞株MGC-803由中國科學院提供。丙泊酚、DMSO、MTT試劑、甲醇均購自美國默克Sigma公司；PBS緩沖液購自北京百奧萊博科技有限公司；兔源ERK一抗、兔源VEGF一抗、β-actin一抗、山羊抗兔lgG二抗均購自英國Abcam公司；Transwell小室購自美國Corning公司；MR-96A型酶標儀購自深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司。

1.2 細胞培養、分組及干預 將細胞株放置在含10%胎牛血清、青霉素及鏈霉素的RPMI-1640培養基中，在溫度37℃、空氣濕度95%、5%CO2的環境下進行常規培養，隔天換液，進行傳代培養，取對數生長期細胞進行試驗。將對數生長期的胃癌細胞隨機分為0、2、4、8 μg/L丙泊酚組，2、4、8 μg/L丙泊酚組分別加入相應濃度的丙泊酚溶液處理72 h。0μg/L丙泊酚組作為對照組。

1.3 細胞增殖能力檢測 采用MTT法。將各組細胞分別接種于96孔板，每組設置3個平行樣本，每孔加入MTT溶液20μL，遮光培養4 h后加入DMSO溶液200μL，振蕩溶解。充分溶解后用酶標儀檢測490 nm波長處的吸光度，計算細胞存活率（%），細胞存活率=（實驗組細胞吸光度/對照組細胞吸光度）×100%。實驗重復3次。

1.4 細胞侵襲能力檢測 采用Transwell小室實驗。將各組細胞懸濁液分別接種于小室的上室，把含血清的培養基放于下室，將細胞放入溫度37℃、空氣濕度95%、5%CO2的環境下常規培養48 h，取出小室后擦去上室中未侵襲的細胞，用甲醇固定10 min后用結晶紫染色，高倍鏡（×100）觀察下室細胞數，隨機抽取3處視野計算細胞數量，實驗重復3次。

1.5 細胞遷移能力檢測 采用細胞劃痕實驗。將各組細胞分別接種于6孔板，待細胞融合至90%，讓細胞在無血清培養基中培養12 h。用1 mL槍頭小心地劃傷單層細胞，棄培養基，用PBS洗凈劃傷細胞，將細胞放置在無血清培養基中繼續培養，在高倍鏡下觀察并拍照記錄0、24 h的劃痕寬度。計算細胞劃痕愈合率，劃痕愈合率（%）=（0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%，實驗重復3次。

1.6 細胞ERK、VEGF蛋白表達檢測 采用Western blotting法。根據蛋白提取試劑盒要求分別提取各組細胞的總蛋白，各取蛋白樣品30μg用SDSPAGE膠進行電泳，蛋白分離后用濕法將蛋白質從凝膠轉移到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉在室溫條件下封閉1 h，然后加入稀釋過的一抗（1∶1 000），在4℃環境下培養過夜，用PBS清洗3遍后加入稀釋過的二抗（1∶10 000），室溫培育1 h，再次用PBS緩沖液清洗3遍，顯色顯影后進行分析。目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/內參蛋白灰度值。

1.7 統計學方法 采用SPSS20.0統計軟件。計量資料用±s表示，多組比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 丙泊酚對胃癌細胞增殖能力的影響 對照組、2μg/mL丙泊酚組、4μg/mL丙泊酚組、8μg/mL丙泊酚組細胞存活率分別為100%、（87.63±9.52）%、（72.21±7.84）%、（57.38±8.29）%。與對照組比較，各丙泊酚組細胞存活率低（P均＜0.05），且隨丙泊酚濃度增加，細胞存活率逐漸降低（P＜0.05）。

2.2 丙泊酚對胃癌細胞侵襲能力的影響 對照組、2μg/mL丙泊酚組、4μg/mL丙泊酚組、8μg/mL丙泊酚組侵襲至小室下室的細胞數目分別為（456.28± 44.34）、（378.91 ± 53.83）、（238.39 ± 52.19）、（169.39±47.87）個。與對照組比較，各丙泊酚組侵襲至小室下室的細胞數目少（P均＜0.05），且隨丙泊酚濃度增加，侵襲至小室下室的細胞數目逐漸減少（P＜0.05）。

2.3 丙泊酚對胃癌細胞遷移能力的影響 對照組、2μg/mL丙泊酚組、4μg/mL丙泊酚組、8μg/mL丙泊酚組細胞劃痕愈合率分別為（41.38±4.38）%、（34.84 ± 3.91）% 、（26.35 ± 3.17）% 、（11.76 ±3.74）%。與對照組比較，各丙泊酚組細胞劃痕愈合率低（P均＜0.05），且隨丙泊酚濃度增加，細胞劃痕愈合率逐漸降低（P＜0.05）。

2.4 丙泊酚對胃癌細胞ERK、VEGF蛋白表達的影響 與對照組比較，各丙泊酚組ERK、VEGF蛋白表達低（P均＜0.05），且隨丙泊酚濃度的增加，胃癌細胞ERK、VEGF蛋白表達逐漸降低（P均＜0.05）。見表1。

表1 各組細胞ERK、VEGF蛋白表達比較（±s）

表1 各組細胞ERK、VEGF蛋白表達比較（±s）

組別對照組2μg/mL丙泊酚組4μg/mL丙泊酚組8μg/mL丙泊酚組FP ERK蛋白1.176±0.414 0.883±0.231 0.626±0.302 0.207±0.175 22.499＜0.05 VEGF蛋白1.617±0.309 1.299±0.238 0.701±0.168 0.336±0.153 66.209＜0.05

3 討論

丙泊酚是一種臨床常用麻醉劑，起效迅速、不良反應小，被廣泛應用于多種手術的靜脈麻醉。但近年來關于丙泊酚的研究逐漸傾向于其對惡性腫瘤細胞的抑制作用［10-12］。關于丙泊酚在胃癌方面的研究，張志發等［13］發現，丙泊酚能夠抑制胃癌細胞的侵襲和遷移，這一過程可能與黏附分子CD44v6和基質金屬蛋白酶7（MMP-7）的表達受到抑制有關。張冰等［14］用不同濃度的丙泊酚處理胃癌細胞，并對胃癌細胞周期和某些蛋白表達進行檢測，結果顯示丙泊酚能夠顯著抑制胃癌細胞增殖，這可能與半胱氨酸蛋白酶3、9水平升高及B淋巴細胞瘤2水平下降有關。馬浩文等［15］對胃癌細胞HGC-27進行研究，結果顯示丙泊酚能夠顯著抑制胃癌細胞的侵襲，且隨著丙泊酚濃度的增加，蛋白激酶B（Akt）的磷酸化水平、MMP-7表達量均降低，推測丙泊酚可能通過調控Akt信號通路抑制胃癌細胞的侵襲。從以上研究可以看出，丙泊酚通過對多種信號通路的調節發揮抑癌作用。本研究結果顯示，與對照組相比，經丙泊酚處理的各組細胞增殖、侵襲及遷移能力均低，且隨丙泊酚濃度增加，胃癌細胞受到的抑制作用越強，說明丙泊酚能夠抑制胃癌細胞的侵襲遷移能力，且丙泊酚的濃度越大，抑制作用越強。

VEGF是一種內皮生長因子，能夠刺激內皮細胞增殖、遷移，是目前已知的在多種惡性腫瘤中均廣泛存在的重要促癌因子［16-18］。有研究顯示，VEGF在胃癌細胞中呈高表達，且能促進淋巴細胞生成［19］。ERK屬于絲裂原活化蛋白激酶中的一種類型，具有調節細胞生長、周期等多種功能，在癌細胞的發展過程中也起重要作用。研究顯示，ERK能夠促進VEGF的表達［20］，由此推測ERK能夠通過促進VEGF的表達發揮促癌作用。與對照組相比，經丙泊酚處理的各組胃癌細胞ERK、VEGF蛋白表達低，且隨丙泊酚濃度的增加，胃癌細胞ERK、VEGF蛋白表達逐漸降低。說明丙泊酚對ERK/VEGF信號通路有抑制作用。

綜上所述，丙泊酚能夠抑制胃癌細胞的增殖、侵襲及遷移，這可能通過調控ERK/VEGF信號通路實現的。關于丙泊酚的抑癌作用，也有研究提示丙泊酚對癌細胞具有雙重作用［21］，可能是丙泊酚濃度和細胞類型不同導致的。因此需擴大丙泊酚濃度范圍和胃癌細胞類型進一步驗證丙泊酚對胃癌細胞的調控作用。