吡非尼酮對(duì)慢性傳輸型便秘小鼠的治療作用及機(jī)制

王博，劉勇，任冰冰，付思齊，姚志偉，孫大慶

天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院兒外科，天津300052

功能性便秘是最常見的消化道疾病，表現(xiàn)為腸道傳輸時(shí)間變慢，糞便干硬，排便次數(shù)減少［1］。慢性傳輸型便秘（STC）作為最常見的功能性便秘，是多種因素（炎癥、分泌功能障礙、消化道神經(jīng)支配的改變）相互作用的結(jié)果［2］。研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生物和短鏈脂肪酸失衡可能是STC發(fā)病的另一危險(xiǎn)因素［3］。STC一般治療包括增加運(yùn)動(dòng)量、高纖維飲食以及藥物干預(yù)。除了高纖維飲食和瀉藥干預(yù)外，益生菌也可以作為STC的替代治療藥物［4］。手術(shù)被認(rèn)為是頑固性STC最后的治療手段。吡非尼酮（PFD）是目前被歐盟批準(zhǔn)的治療特發(fā)性肺纖維化的兩種藥物之一。PFD可改善輕中度肺纖維化患者的肺功能，降低患者病死率，延長(zhǎng)無進(jìn)展生存期［5-6］。PFD通過多種機(jī)制發(fā)揮抗纖維化的作用，包括下調(diào)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)，降低肌成纖維細(xì)胞的活化［7-8］。PFD還是活性氧（ROS）清除劑，可下調(diào)氧化相關(guān)基因的表達(dá)，減少過氧化氫和ROS的產(chǎn)生［9］。研究發(fā)現(xiàn)，STC的結(jié)腸組織中存在氧化應(yīng)激損傷［10］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，STC患者骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP2）蛋白表達(dá)升高。2020年9月—2021年3月，本研究探究PFD對(duì)STC小鼠的治療作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑及儀器 SPF級(jí)雄性BALB/c小鼠50只，6～8周齡，體質(zhì)量（20±2）g，購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司（合格證號(hào)：No.370726201100859673），并于山東大學(xué)生命科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。PFD購自大連美侖生物技術(shù)有限公司，純度＞98.5%。洛哌丁胺購自美國(guó)Sigma公司；TNF-α抗體購自美國(guó)Abcam公司；HE染色試劑盒購自中國(guó)南京BioChannel公司；TNF-α抗體、蛋白基因產(chǎn)物（PGP）9.5抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.2 動(dòng)物分組及模型制備 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將其隨機(jī)分為對(duì)照組、STC組及1、10、100 mg/kg治療組，各10只。STC組、各治療組給予10 mg/kg洛派丁胺溶液（美國(guó)Sigma公司）灌胃，對(duì)照組給予等量生理鹽水灌胃，均2次/日，持續(xù)2周。自造模第8天，各治療組在洛哌丁胺灌胃3 h后分別給予1、10、100 mg/kg的PFD灌胃，1次/日，持續(xù)1周。

1.3 小鼠一般情況及糞便參數(shù)記錄 每天對(duì)小鼠的體質(zhì)量、飲水量、攝食量進(jìn)行監(jiān)測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，采集糞便樣本進(jìn)一步分析。給藥14 d后，將小鼠禁食16 h，給予100 g/L活性炭混懸液2 mL灌胃處理。記錄各組第1顆黑色糞便排出時(shí)間，測(cè)量單只小鼠每小時(shí)排便次數(shù)，并計(jì)算糞便含水量，糞便含水量=（糞便濕重-糞便干重）/糞便濕重×100%。

1.4 結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)變化觀察 干預(yù)完成后將小鼠頸椎脫臼處死取結(jié)腸段組織，用生理鹽水沖洗結(jié)腸內(nèi)容物，剪取新鮮結(jié)腸1 cm，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋后切片，切片厚度5μm。組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟和梯度乙醇脫水后，用HE染色試劑盒染色，中性樹脂封片后，在光學(xué)顯微鏡（×10）下觀察結(jié)腸組織形態(tài)。剝離小鼠結(jié)腸肌層，采用肌間神經(jīng)元全層鋪片，用PGP9.5神經(jīng)元特異性指標(biāo)染色。剪取遠(yuǎn)端結(jié)腸段（2～3 cm）置于含氧磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中，沿腸系膜邊緣切開，清除其內(nèi)容物，最大限度地拉伸并剝離肌層，用4%多聚甲醛固定過夜。37℃條件下，將肌層用5%山羊血清封閉30 min。孵育PGP9.5抗體（14730-1-AP，1∶100），并在4℃條件下孵育過夜，PBS清洗一抗后，加入二抗并在37℃下孵育1 d。蔡司激光共聚焦顯微鏡LSM880（×20）觀察結(jié)腸肌層神經(jīng)元形態(tài)變化。用抗TNF-α抗體進(jìn)行免疫組化染色評(píng)估結(jié)腸組織中炎癥反應(yīng)發(fā)生的位置及程度。方法：結(jié)腸組織石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，將切片浸入檸檬酸鈉抗原修復(fù)液中煮20 min，取出切片自然冷卻致室溫，用0.3%過氧化氫溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶10 min，5%山羊血清封閉10 min，滴加TNF-α抗體（1∶100稀釋），4℃孵育過夜，清洗一抗后，二抗室溫孵育30 min，滴加DAB顯色液于光學(xué)顯微鏡（×20）下觀察，著色為棕色特異性區(qū)域既存在TNF-α表達(dá)。用Image J軟件統(tǒng)計(jì)TNF-α陽性面積百分比，值越高則炎性反應(yīng)程度越高。

1.5 結(jié)腸組織中BMP2、Smad同源物1（Smad 1）mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用定量PCR法。小鼠結(jié)腸標(biāo)本保存于RNAlater溶液（廣州大匯生物技術(shù)有限公司）中。提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得互補(bǔ)cDNA。采用特異性引物，β-actin上游引物5'-CCACCATGTACCCAGGCATT-3'，下游引物 5'-CGGACTCATCGTACTCCTGC-3'；BMP2 上 游 引 物 5'-CTCCGGGCTATCATGCCTTT-3'，下游引物 5'-ACAACATGGAGATTGCGCTG-3'；Smad1 上游引物 5'-AATACTTCACTGAGGCGGGC-3'，下 游 引 物 5'-CAGTGAGCACATCTGTCCGT-3'。反應(yīng)體系中PrimeScript酶液1.0μL、引物各1.0 μL、5×PrimerScript buffer2 4.0μL、無菌蒸餾水14μL、cDNA模板10μL。擴(kuò)增條件：95℃起始10 min，95℃ 10 s、60 ℃ 30 s共40個(gè)循環(huán)。以β-actin 為內(nèi)參基因，用 2-ΔΔCt法［11］計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)樣本重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PFD對(duì)小鼠排便的影響 與對(duì)照組比較，STC組第1顆黑色糞便排出時(shí)間長(zhǎng)、排便頻率低（P均＜0.05）。1、10 mg/kg治療組第1顆黑色糞便排出時(shí)間、排便頻率與STC組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）；與STC組及1.10 mg/kg治療組比較，100 mg/kg治療組第1顆黑色糞便排出時(shí)間短、排便頻率高（P均＜0.05）。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇100 mg/kg治療組進(jìn)行觀察。見表1。

表1 各組排便情況比較（±s）

表1 各組排便情況比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，#P＜0.05；與100 mg/kg治療組比較，*P＜0.05。

組別對(duì)照組STC組1 mg/kg治療組10 mg/kg治療組100 mg/kg治療組n 10 10 10 10 10第1顆黑色糞便排出時(shí)間（min）83.3±13.4 196.7±63.8#*200.0±69.0*177.3±70.1*98.5± 4.5*排便頻率（次/小時(shí)）8.43±1.73 2.68±1.33#3.18±1.21 3.22±1.23 5.66±1.82*糞便含水量（%）68.59±15.36 47.50± 9.35#49.22± 5.23 52.32± 6.32 60.88± 2.60*

2.2 PFD對(duì)小鼠一般情況的影響 與對(duì)照組比較，STC組體質(zhì)量低，攝食量、飲水量少（P均＜0.05）。與STC組比較，100 mg/kg治療組體質(zhì)量高，攝食量、飲水量多（P均＜0.05）。見表2。

表2 各組一般生理狀態(tài)比較（±s）

表2 各組一般生理狀態(tài)比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，#P＜0.05；與STC組比較，*P＜0.05。

組別對(duì)照組STC組100 mg/kg治療組n 10 10 10體質(zhì)量（g）23.12±0.65 19.15±0.98#21.25±0.74*攝水量（mL）9.02±1.92 5.39±0.65#6.54±1.06*攝食量（g）4.13±1.12 1.99±0.61#2.98±0.55*

2.3 PFD對(duì)小鼠腸道組織形態(tài)的影響 對(duì)照組腸壁結(jié)構(gòu)完整，腸絨毛分布均勻，腸管壁較厚；STC組結(jié)腸腸壁組織較薄，肌層變薄明顯，可見少許炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；100 mg/kg治療組治療1周后小腸腸壁明顯增厚，結(jié)腸腸黏膜發(fā)育良好，腸絨毛豐厚，排列緊密，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，未見明顯組織病理損傷。對(duì)照組、STC組、100 mg/kg治療組TNF-α陽性面積百分比分別為（0.82±0.25）%、（10.12 ± 0.98）%、（3.12 ± 0.65）%，均在結(jié)腸肌層。與對(duì)照組比較，STC組TNF-α陽性面積百分比高（P＜0.05）；與STC組比較，100 mg/kg治療組TNF-α陽性面積百分比低（P＜0.05）。STC組結(jié)腸肌間神經(jīng)分布稀疏，神經(jīng)纖維變細(xì)，胞體減少；而100 mg/kg治療組神經(jīng)元的以上變化發(fā)生逆轉(zhuǎn)。

2.4 PFD對(duì)小鼠結(jié)腸組織中BMP2、Smad1 mRNA表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，STC組結(jié)腸組織中BMP2、Smad1 mRNA相對(duì)表達(dá)量高（P均＜0.05）；與STC組比較，100 mg/kg治療組結(jié)腸組織中BMP2、Smad1 mRNA相對(duì)表達(dá)量低（P均＜0.05）。見表3。

表3 各組結(jié)腸組織中BMP2、Smad1 mRNA表達(dá)比較（±s）

表3 各組結(jié)腸組織中BMP2、Smad1 mRNA表達(dá)比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，#P＜0.05；與STC組比較，*P＜0.05。

組別對(duì)照組STC組100 mg/kg治療組n 10 10 10 BMP2 mRNA 1.01±0.16 3.12±0.12#1.08±0.03*Smad1 mRNA 1.04±0.11 2.75±0.18#1.08±0.04*

3 討論

STC是一種常見的功能性便秘，其特點(diǎn)是結(jié)腸運(yùn)動(dòng)緩慢，腸道傳輸時(shí)間延長(zhǎng)，排便次數(shù)顯著減少甚至不排便，糞便干硬及水分減少。該病為慢性、復(fù)發(fā)率高，常影響患者的日常生活［12］。研究表明，結(jié)腸腫瘤、帕金森病、兒童相關(guān)多動(dòng)癥、自閉癥及慢性腎臟疾病均與便秘有關(guān)［2］。對(duì)慢性便秘特別是STC的研究在了解疾病的發(fā)生機(jī)制及治療中有重要作用。STC的正常治療包括飲食控制、運(yùn)動(dòng)、使用瀉藥等。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，慢性便秘患者的結(jié)腸存在慢性炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激損傷，抗炎抗氧化應(yīng)激治療也越來越多被應(yīng)用在便秘患者的治療中。PFD作為一種新的抗炎抗氧化應(yīng)激損傷的藥物，是否可以用來治療便秘，其作用方式及潛在的藥物靶點(diǎn)尚不清楚。本研究通過PFD治療洛哌丁胺誘導(dǎo)的STC小鼠，觀察便秘相關(guān)參數(shù)證明PFD對(duì)STC的治療作用。

通過PFD的臨床特點(diǎn)與羅馬Ⅳ診斷標(biāo)準(zhǔn)，本研究設(shè)計(jì)了第1顆黑色糞便排出的時(shí)間來觀察腸道傳輸時(shí)間，以每小時(shí)糞便顆粒數(shù)作為排便頻率，并統(tǒng)計(jì)糞便含水量。在STC小鼠模型中，PFD可增加糞便含水量，減少第1顆黑色糞便排出時(shí)間，增加排便頻率，同時(shí)減少炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，增加結(jié)腸肌層厚度，增強(qiáng)腸道動(dòng)力。BMP2-Smad1調(diào)節(jié)通路可以調(diào)節(jié)腸神經(jīng)元的發(fā)生與重塑，同時(shí)BMP2升高可增加腸道硝基能神經(jīng)元，從而增加抑制性神經(jīng)遞質(zhì)一氧化氮（NO）產(chǎn)生，NO抑制腸道收縮導(dǎo)致腸道傳輸功能異常。BMP2高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致腸神經(jīng)元結(jié)構(gòu)與功能異常。本研究顯示，PFD可下調(diào)STC小鼠結(jié)腸BMP2、Smad1基因表達(dá)，通過抑制BMP2-Smad1信號(hào)軸減少腸道神經(jīng)元的重塑，逆轉(zhuǎn)腸神經(jīng)結(jié)構(gòu)變化與腸道調(diào)節(jié)功能的失常。TNF-α是最常見的周圍炎癥反應(yīng)介質(zhì)，其在慢性與急性炎癥反應(yīng)中水平均升高，在神經(jīng)性疾病中亦合成增加。STC小鼠模型結(jié)腸肌層組織中TNF-α與對(duì)照組相比明顯升高，且表達(dá)位置與腸道神經(jīng)元存在共定位。說明STC小鼠結(jié)腸肌層組織中的腸神經(jīng)元存在炎癥損傷，PFD可減少STC小鼠結(jié)腸肌層中的TNF-α表達(dá)來發(fā)揮抗炎與神經(jīng)保護(hù)作用。

隨著對(duì)PFD研究的深入，PFD在消化系統(tǒng)中的作用逐漸被發(fā)現(xiàn)。PFD可呈劑量依賴性抑制人類腸道纖維細(xì)胞的增殖和遷移，但不導(dǎo)致其死亡，從而有效抑制炎癥性腸病中腸纖維化的發(fā)生發(fā)展［13］。PFD可通過抑制氧化應(yīng)激、巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)和炎癥小體依賴性的NLRP3途徑誘導(dǎo)的炎癥，來減輕急性腎損傷［14］。PFD可抑制克隆恩病患者腸道源性成纖維細(xì)胞增殖和基質(zhì)金屬蛋白酶的產(chǎn)生，且呈劑量依賴性［15］。這些研究均從PFD對(duì)于腸道的免疫調(diào)節(jié)入手，通過體內(nèi)與體外實(shí)驗(yàn)證明了PFD的抑制腸道炎癥的作用。本研究不僅證明了PFD可以有效降低腸道炎癥反應(yīng)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了PFD可以通過BMP2-SMAD1通路調(diào)節(jié)腸道神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)與功能，具有神經(jīng)保護(hù)作用。由此可見PFD作為一個(gè)常規(guī)的抗肺纖維化藥物的同時(shí)，可通過抗炎作用在多種急性慢性疾病中發(fā)揮作用。

本研究中PFD不僅能改善便秘，還能糾正洛哌丁胺誘導(dǎo)便秘導(dǎo)致的小鼠體質(zhì)量丟失與結(jié)腸組織病理的改變。盡管目前有很多植物提取物、多糖、小分子化合物、中草藥被用來研究對(duì)于便秘的改善作用，但是很少有藥物能在100 mg/kg的劑量下，單獨(dú)處理STC模型小鼠中驗(yàn)證其通便作用，PFD相較于其他通便藥物具有較低的起效濃度，并且未出現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)，安全性高。接下來的研究中，我們將進(jìn)一步探索PFD對(duì)腸道微生物及其代謝產(chǎn)物的調(diào)控作用。

綜上所述，本研究驗(yàn)證了PFD在STC的腸道運(yùn)動(dòng)中起重要的調(diào)節(jié)作用。其作用機(jī)制可能為PFD能夠通過調(diào)控BMP2-Smad1信號(hào)軸減輕腸神經(jīng)的損傷，抑制腸道炎癥反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)腸道微生物多樣性改變，從而直接或間接改善了便秘癥狀。