結腸癌組織中miR-129-5p、BDNF表達變化及意義

宋立強，張博淼，薛偉男，崔濱濱

哈爾濱醫科大學附屬腫瘤醫院結直腸外科，哈爾濱150081

結腸癌是消化道常見惡性腫瘤，2018年統計顯示，我國結腸癌發病率居惡性腫瘤第3位，新發病例達37.6萬例［1］。目前結腸癌發病機制尚不完全明確，唯一可治愈的手段為根治性手術切除，但大多數患者確診時已達中晚期，即使可進行手術治療，也易出現復發、轉移［2］。因此，亟需尋找潛在診治靶點。微小RNA（miRNA）是一種進化上高度保守的單鏈非編碼小分子RNA，可通過調控靶基因表達參與腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲等生物學過程［3］。miR-129-5p為miR-129成熟產物，miR-129-5p在喉癌中呈高表達［4］，但在乳腺癌、結腸癌中呈低表達［5-6］。腦源性神經營養因子（BDNF）是一種神經營養物質，可促進神經細胞分化、生長、修復等。近年研究報道，BDNF與包括結腸癌在內的多種惡性腫瘤發生密切相關，參與腫瘤轉移、血管新生等過程［7］。miR-129-5p和BDNF在結腸癌中表達異常，在結腸癌發生發展中發揮重要作用，但關于兩者與結腸癌臨床病理特征和預后關系的研究較少。本研究對此做了探討。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年1月—2017年12月本院收治的結腸癌患者118例，男70例，女48例；年齡34～76（53.11 ± 10.54）歲；腫瘤直徑＞5 cm 53例，≤5 cm 65例；腫瘤分化程度：高中分化71例，低分化47例；TNM分期［8］：Ⅰ、Ⅱ期64例，Ⅲ期54例；浸潤深度：T1、263例，T3、455例；有淋巴結轉移56例。納入標準：經病理檢查確診為原發性結腸癌；初次確診，未接受任何治療；臨床病理資料完整；接受根治性或姑息性手術。排除標準：合并其他部位腫瘤；嚴重心、肝、腎等臟器疾病；全身感染性疾病；血液系統疾病。本研究經醫院醫學倫理委員會批準；患者及家屬均知情同意。

1.2 組織中miR-129-5p、BDNFmRNA表達檢測 采用qRT-PCR。取術中切除的結腸癌組織及癌旁組織（距離腫瘤組織邊緣≥5 cm）。TRIzol總RNA抽提試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司）提取組織中總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，Qiagen逆轉錄試劑盒（上海易匯生物科技有限公司）合成cDNA，加入miR-129-5p、BDNF引物，miR-129-5p正向引物5'-GTCGTATGCTAGCGTGCTTG-3'，反 向 引 物 5'-CAAATATCCGCCCAGTATTG-3'；U6 正 向 引 物 5'-GTCCTATATGGTCATTCCGA-3'，反 向 引 物 5'-ATACGACATTTTCGGCATGG-3'；BDNF正向引物5'-TTAGCGAGTGGGTCACAGCG-3'，反向引物 5'-ATTGGGTAGTTCGGCATTGC-3'；β-actin正向引物 5'-CACGATCGAGGCCGACTATC-3'，反向引物5'-TAATGACGAGATGCAACAGT-3'。分別以U6、β-actin為內參校正，進行qRT-PCR檢測。反應體系：SYBR Premix Ex TaqⅡ 12.5 μL、上游引物2 μL、下游引物2μL、DNA 模板 2μL、dH2O 8.5μL。反應條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s循環40次。用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。

1.3 隨訪 患者出院后均通過門診或電話方式隨訪，隨訪至2020年12月，統計3年總生存率。

1.4 統計學方法 采用SPSS26.0統計軟件。偏態分布或方差不齊的計量資料以中位數（上四分位數，下四分位數）［M（QL，QU）］表示，比較采用Z檢驗；相關性分析采用Spearman相關法；繪制Kaplan-Meier法生存曲線，生存率比較采用Log-rank檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結腸癌及癌旁組織中miR-129-5p、BDNFmRNA表達比較 結腸癌及癌旁組織中miR-129-5p相對表 達 量 分 別 為 0.67（0.54，0.83）、1.02（0.83，1.24），BDNF相對表達量分別為2.58（1.97，3.11）、1.66（1.49，1.79）。與癌旁組織比較，結腸癌組織中miR-129-5p相對表達量低，BDNF相對表達量高（P均＜0.05）。

2.2 miR-129-5p、BDNF mRNA表達與結腸癌患者臨床病理特征的關系 miR-129-5p、BDNFmRNA表達與結腸癌分化程度、TNM分期、浸潤深度、淋巴結轉移有關（P均＜0.05），與患者性別、年齡、腫瘤直徑無關（P均＞0.05）。見表1。

表1 miR-129-5p、BDNF mRNA表達與結腸癌患者臨床病理特征的關系

2.3 結腸癌組織中miR-129-5p表達與BDNFmRNA表達的相關性 Spearman相關性分析顯示，結腸癌組織中miR-129-5p表達與BDNF mRNA表達呈負相關（rs=-5.174，P＜0.05）。

2.4 miR-129-5p、BDNF mRNA表達與結腸癌患者預后的關系 隨訪3～36個月，中位隨訪時間16個月，無失訪病例，存活69例，總生存率為58.47%（69/118）。 以 結 腸 癌 組 織 中 miR-129-5p、BDNF mRNA表達的中位數為基準，將結腸癌患者分為高、低表達組。miR-129-5p高表達組3年總生存率為79.03%（49/62），miR-129-5p低表達組3年總生存率為37.50%（21/56）；BDNF高表達組3年總生存率為39.62%（21/53），BDNF低表達組3年總生存率為73.85%（48/65）。miR-129-5p高表達組3年總生存率高于miR-129-5p低表達組，BDNF高表達組3年總生存率低于BDNF低表達組（P均＜0.05）。

3 討論

我國是結腸癌新發病例和死亡病例數最多的國家，已嚴重影響和威脅居民生命健康。早期結腸癌主要臨床表現為大便性狀改變、排便習慣改變、腹部腫塊、腹痛或不適等，多不具備典型特征，未能引起患者注意。因此，大多確診時已達中晚期，失去最佳治療時機［9］。結腸癌的發生發展是多因素、多基因參與的復雜過程，亟需了解其分子機制，以尋找理想的診斷標志物和特異性治療靶點。

隨著基因組測序技術的快速發展，近年來越來越多無蛋白質編碼功能的RNA被發現。miRNA是一類長19～25個核苷酸的內源性非編碼小RNA，具備轉錄后水平調節基因表達功能，多位于腫瘤相關的脆性位點或基因區域，廣泛參與腫瘤病理生理過程［10-11］。miR-129-5p為miR-129-1和miR-129-2共同轉錄產物，近年研究報道其在多種惡性腫瘤中發揮重要作用。如miR-129-5p在肺癌組織中表達顯著下調，可通過靶向抑制血管內皮生長因子抑制癌細胞遷移和侵襲能力［12］。miR-129-5p在肝癌組織中表達下調，上調其表達可通過調節鈣調蛋白依賴性蛋白激酶4抑制癌細胞增殖、遷移、入侵［13］。但在喉癌組織中miR-129-5p表達顯著上調，可通過靶向含WW結構域的E3泛素蛋白連接酶1促進癌細胞增殖和入侵［4］。提示miR-129-5p可通過調控下游靶基因發揮促癌或抑癌基因作用。本研究結果顯示，結腸癌組織中miR-129-5p表達明顯低于癌旁組織，與腫瘤分化程度、TNM分期、浸潤深度、淋巴結轉移相關。說明miR-129-5p可能參與調控結腸癌分化、侵襲、轉移等生物功能，具有抑癌基因作用。本研究結果還顯示，miR-129-5p高表達組術后3年總生存率高于miR-129-5p低表達組，說明miR-129-5p可能成為評估結腸癌預后的生物標志物。胡俊華等［14］將miR-129-5p轉染至結腸癌藥細胞株LoVo/5-氟尿嘧啶，發現miR-129-5p可通過靶定胸苷酸合成酶增加癌細胞對5-氟尿嘧啶的敏感性，提升5-氟尿嘧啶抗腫瘤作用，細胞毒性檢測也顯示，轉染細胞半數致死濃度從（1 089.70±5.86）μg/L降至（261.40±6.81）μg/L，進一步說明miR-129-5p可能成為結腸癌新的治療靶點。

BDNF為神經營養因子家族一員，主要分布于內分泌系統、外周神經系統、大腦中樞神經系統，定位于細胞質，可通過結合其配體酪氨酸激酶受體B，維持腦細胞正常生理功能［15］。近年研究發現，多種惡性腫瘤中可檢測到BDNF高表達，提示BDNF與腫瘤惡性生物學行為密切相關。如非小細胞肺癌組織中BDNF表達顯著上調，可通過PI3K/Akt信號通路促進癌細胞增殖［16］。肝癌組織中BDNF表達顯著上調，可通過抑制miR-584表達促進癌細胞增殖、侵襲、淋巴結轉移［17］。本研究結果顯示，結腸癌組織中BDNF表達明顯高于癌旁組織，與分化程度、TNM分期、浸潤深度、淋巴結轉移相關，說明BDNF可能參與結腸癌分化、侵襲、轉移等生物功能，具有促癌基因作用，但關于其作用機制尚不明確。Ras/MAPK和PI3K/Akt信號通路異常與細胞生存、增殖、惡性轉變等過程相關，也參與了結腸癌進程［18］。研究表明，BDNF可通過Ras/MAPK和PI3K/Akt信號通路為腫瘤增殖和存活提供正向刺激信號［7］。因此推測BDNF可能通過Ras/MAPK和PI3K/Akt信號通路參與結腸癌發生發展，這有待進一步研究證實。本研究結果顯示，BDNF高表達組總生存率明顯低于BDNF低表達組，說明BDNF可能成為評估結腸癌預后的生物標志物。進一步分析發現，結腸癌組織中miR-129-5p、BDNF表達呈負相關關系，提示在結腸癌中miR-129-5p與BDNF可能存在靶向調控關系，共同影響結腸癌發生、發展。近期研究報道，多發性骨髓瘤中過表達miR-129-5p能抑制RPMI8226細胞增殖，與BDNF表達呈負相關，miR-129-5p與BDNF存在結合位點，雙熒光素酶報告基因實驗驗證兩者存在靶向關系［19］。但對于miR-129-5p是否能靶向負向調控結腸癌BDNF表達發揮作用尚不明確，還有待進一步研究。

綜上所述，結腸癌組織中miR-129-5p低表達，BDNF高表達，二者表達呈負相關關系，與結腸癌分化、侵襲、轉移相關，有望成為結腸癌診斷和預后評估的標志物。但本研究樣本量較少，隨訪時間較短，還需大樣本研究進一步分析miR-129-5p與BDNF的關系。