結腸癌組織中LncRNA LINC01224的表達變化及意義

吳華杰，鮑柏軍，李森，蔣向陽，章培

1張家港澳洋醫院消化內科，江蘇張家港215624；2南通大學附屬醫院消化內科；3張家港澳洋醫院腫瘤科；4張家港澳洋醫院病理科

結腸癌是臨床常見惡性腫瘤之一，其全球發病率與病死率分別居惡性腫瘤第3、2位，給人們健康造成嚴重威脅［1-2］。目前結腸癌發病機制尚不明確，根治性手術切除為唯一可治愈手段，但因大多數患者確診時已為中晚期，即使接受手術治療，也易出現復發、轉移。因此，亟需尋找潛在的診斷和治療靶點。90%以上人類基因可被轉錄為非編碼RNA。研究表明，腫瘤的發生發展過程中存在多種非編碼RNA異常表達［3］。長鏈非編碼RNA（LncRNA）是一類長度＞200個核苷酸的非編碼RNA，其在結腸癌發生發展過程中發揮重要的調控作用［4-5］?；蜷g區長鏈非編碼RNA01224（LINC01224）是一種 LncRNA，目前其與結腸癌的關系尚不明確。本研究對此做了探討。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取張家港澳洋醫院2016年1月—2017年12月收治的結腸癌患者83例，其中男49例，女34例；年齡37～78（52.10 ± 8.62）歲；腫瘤直徑：≥5 cm 37例，＜5 cm 46例；分化程度：低分化33例，中分化31例，高分化19例；TNM分期［6］：Ⅰ期22例，Ⅱ期23例，Ⅲ期38例；浸潤深度：T119例，T225例，T327例，T412例；有淋巴結轉移39例，無淋巴結轉移44例。納入標準：經病理檢查確診為原發性結腸癌；均初次確診，術前未接受任何抗腫瘤治療；患者或其家屬知情同意；臨床病理資料完整；接受根治性或姑息性手術切除。排除標準：合并其他部位腫瘤；嚴重心、肝、腎等臟器疾?。蝗砀腥拘约膊?；血液系統疾??；不能接受隨訪。本研究經醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 組織中LINC01224表達檢測 采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）。手術切除結腸癌組織及距離癌組織邊緣≥5 cm的癌旁組織，用TRIzol總RNA抽提試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司）提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性，Qiagen逆轉錄試劑盒（上海易匯生物科技有限公司）合成cDNA，加入LINC01224引物，上游引物5'-TGACACTTCTTGCCTGCAAC-3'，下 游 引 物 5'-ACTTCTGCTTCCCGAGTTCA-3'。根據qRT-PCR試劑盒（上海吉瑪制藥技術有限公司）說明書配制反應體系，以U6作為內參校正，上游引物5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'，下 游 引 物 5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'。qRT-PCR儀（美國羅氏公司），型號：LightCycler480Ⅱ；反應體系：20～100μL。反應條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s循環40次。用2-ΔΔCt法計算LINC01224相對表達量。

1.3 隨訪 患者出院后均通過門診或電話方式隨訪，隨訪至2020年12月，統計3年生存率。

1.4 統計學方法 采用SPSS26.0統計軟件。服從正態分布的計量資料以±s表示，比較采用獨立樣本t檢驗；計數資料比較采用χ2檢驗；繪制Kaplan-Meier法生存曲線，生存率比較采用Log-Rank檢驗；多因素Cox回歸分析結腸癌患者預后的影響因素。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 癌組織及癌旁組織中LINC01224表達比較 癌組織及癌旁組織中LINC01224相對表達量分別為0.98±0.21、0.40±0.18。癌組織中LINC01224相對表達量高于癌旁組織（t=19.206，P＜0.01）。

2.2 LINC01224表達與結腸癌患者臨床病理特征的關系 LINC01224表達與結腸癌TNM分期、浸潤深度、淋巴結轉移有關（P均＜0.05），與性別、年齡、腫瘤直徑、分化程度無關（P均＞0.05）。見表1。

表1 LINC01224表達與結腸癌患者臨床病理特征的關系

2.3 LINC01224表達與結腸癌患者預后的關系83例患者隨訪4～36（25.23± 6.55）個月，死亡22例，3年總生存率為73.49%（61/83）。以LINC01224相對表達量的均值為基準，分為高低表達組。LINC01224高表達組（n=42）死亡17例，3年總生存率為59.52%（25/42），低表達組（n=41）死亡5例，3年總生存率為87.80%（36/41）。Kaplan-Meier法生存曲線顯示，LINC01224高表達組3年總生存率低于低表達組（P＜0.01）。

2.4 結腸癌患者預后的影響因素

2.4.1 單因素分析 單因素分析顯示，死亡患者年齡≥60歲、TNM分期Ⅲ期、浸潤深度T3、4、淋巴結轉移比例及LINC01224相對表達量高于生存患者（P均＜0.05）。見表2。

表2 影響結腸癌患者預后的單因素分析

2.4.2 多因素Cox回歸分析 以性別、年齡（≥60歲=1，＜60歲=0）、TNM分期（Ⅲ期=1，Ⅰ、Ⅱ期=0）、浸潤深度（T3、4=1，T1、2=0）、淋巴結轉移（有=1，無=0）、LINC01224表達為自變量，預后情況（死亡=1，存活=0）為因變量，多因素Cox回歸分析顯示，TNM分期Ⅲ期、有淋巴結轉移和LINC01224高表達為結腸癌患者預后的獨立危險因素（P均＜0.05）。見表3。

表3 影響結腸癌患者預后的多因素Cox回歸分析

3 討論

我國是全球結直腸癌新發病例和死亡病例最多的國家。中國惡性腫瘤流行病學調查顯示，2015年全國結直腸癌新發病例和死亡病例分別為38.8萬、18.7萬，發病率和死亡率分別為28.20/10萬、13.61/10萬［7］。隨著我國生活方式和飲食結構逐漸改變，結腸癌發病率呈上升趨勢，但5年總生存率低于40%，遠低于西方國家［8］。早期結腸癌臨床癥狀并不明顯，大多患者確診時已失去最佳治療時機，同時還缺乏早期診斷敏感標志物，手術、化療雖然具有一定效果，但預后多較差。結腸癌的發生發展是多因素、多基因參與的復雜過程，目前分子靶向治療已成為腫瘤研究重點，但結腸癌尚缺乏相關治療靶點。因此，亟需了解其分子機制，以尋找理想的診斷標志物和特異治療靶點［9］。

非編碼RNA是一類不編碼蛋白質的RNA，在RNA水平就可行使各自的生物學功能，比如免疫應答，細胞增殖、分化、凋亡，胚胎發育等。近年來隨著基因組測序技術的快速發展，越來越多無蛋白質編碼功能的RNA被發現。LncRNA可通過調控蛋白編碼基因的表達、調節選擇性剪接過程、控制表觀遺傳調控過程參與細胞生長、發育和癌細胞侵襲、轉移等生物學過程［10］。作為分子調控的重要“開關”，LncRNA已逐漸成為結腸癌治療的新靶標。LINCRNA為數目最多的一類LncRNA，研究表明，其啟動子區域上轉錄因子結合位點的遺傳突變可引起LncRNA異常表達，進而影響疾病發生發展［11］。LINC01224為新發現的一種LncRNA，已有研究發現，其參與了多種惡性腫瘤進程。通過癌癥基因組圖譜數據庫篩選乳腺癌相關差異表達LncRNA，發現LINC01224在乳腺癌中表達顯著上調，與患者預后相關，認為其在乳腺癌癌變過程中發揮特定作用［12］。研究顯示，上皮性卵巢癌中LINC01224表達顯著上調，可通過LINC01224/微小RNA-485-5p/p21激活激酶4信號途徑促進上皮性卵巢癌進展［13］。肝癌中LINC01224表達顯著上調，沉默其表達可通過競爭性結合miR-330-5p降低細胞周期檢測點激酶1表達，抑制肝癌進展［14］。但關于LINC01224與結腸癌的關系尚不明確。本研究結果顯示，結腸癌組織中LINC01224表達明顯高于癌旁組織，與結腸癌TNM分期、浸潤深度、淋巴結轉移有關，說明LINC01224可能參與調控結腸癌細胞分化、侵襲、轉移等過程，具有致癌基因作用。進一步分析顯示，LINC01224高表達組3年總生存率明顯低于低表達組，LINC01224高表達患者3年死亡風險增加6.155倍。說明LINC01224可能成為評估結腸癌預后的生物標志物，但關于其作用機制尚不明確。

miRNA是一類內源性非編碼小RNA，具備轉錄后水平調節基因表達功能，多位于腫瘤相關的脆性位點或基因區域，廣泛參與腫瘤的病理生理過程［15-16］。研究表明，LncRNA可通過堿基互補結合，吸附特定miRNA，干擾miRNA對下游靶基因的調控，即“海綿效應”［17］。我們檢索 LncBase Predicted v.2數據庫發現，LINC01224為miR-513b-5p競爭性內源RNA分子，具有負向調控作用。目前已有大量研究證實，miR-513b-5p在包括結腸癌在內的多種惡性腫瘤中發揮抑癌基因角色。研究顯示，非小細胞肺癌中miR-513b-5p表達明顯下調，提升miR-513b-5p表達可下調鋅指結構反義轉錄本1抑制非小細胞肺癌細胞增殖、遷移、侵襲能力［18］。結腸癌中miR-513b-5p表達明顯下調，且證實miR-513b-5p可通過靶向信號傳導及轉錄激活因子3抑制結腸癌增殖和遷移［19］。張兆輝等［20］通過體外細胞試驗也證實，干擾LINC01224表達可競爭性結合miR-513b-5p調節結腸癌細胞SW1116增殖、遷移、侵襲能力。因此推測，LINC01224可能通過靶向抑制miR-513b-5p表達，從而影響結腸癌TNM分期、浸潤深度、淋巴結轉移和預后，但還需要進一步研究證實。

綜上所述，結腸癌組織中LINC01224高表達，其表達變化與TNM分期、浸潤深度、淋巴結轉移相關，為患者預后影響因素，可能成為結腸癌診斷和預后評估的標志物。但本研究樣本量較少，且隨訪時間較短，還需大樣本研究進一步探討LINC01224在結腸癌發生發展中發揮的癌基因作用。