人Plecstrin同源域家族A成員1表達與膠質瘤惡性表型相關性研究☆

劉俊 陳銘 陶幫寶 張卿云

雖然當今在膠質瘤的增殖和遷移方面已經取得了一系列的成果，然而膠質瘤患者的生活質量和總體生存情況并沒有得到明顯改善[1-3]。因此，進一步研究膠質瘤的分子生物學特性對于延長患者的整體生存期仍然具有重要意義。人 Plecstrin同源域家族 A成員 1（Pleckstrin homology like domain family A member 1，PHLDA1）mRNAs 表達變化已在成人多形性膠質母細胞瘤（GBM）和兒童星形細胞瘤中得到證實[4]。PHLDA1是一種多功能蛋白，在包括細胞凋亡在內的多種生物學過程中發揮著獨特的作用，在不同類型的癌癥中已經檢測到了PHLDA1的變化。在原發性和轉移性黑色素瘤中發現PHLDA1的表達下降，而在腸道和胰腺腫瘤中其表達升高[5-6]。然而，PHLDA1在膠質瘤表型的具體作用尚不清楚。膠質瘤患者的病理標本能很好的反應膠質瘤本身的生物學特性，但是考慮到腫瘤的異質性，同一病理組織可能存在多種不同生物學特性的膠質瘤細胞。因此在進行某一細胞因子對膠質瘤生物學特性影響的研究時，較為科學的方法是針對單一的細胞系進行研究。目前最常應用的兩種膠質瘤細胞系為U87及U251。本研究中，我們針對性分析了PHLDA1在不同級別膠質瘤中的表達以及在這兩種膠質瘤細胞系中增殖和遷移中的作用，從而探討PHLDA1基因在膠質瘤中的增殖侵襲作用機制。

1 材料與方法

1.1 研究對象采集2015年1月至2020年4月65例膠質瘤標本，這些標本來自于馬鞍山市中心醫院神經外科和上海新華醫院神經外科。尸檢非膠質瘤患者5例腦組織作為對照組。病理診斷依據2016年WHO制定的中樞神經系統腫瘤分類標準（其中2015-2016年的標本分類經2名病理醫師重新驗證）。研究程序獲得2家醫院倫理委員會批準，并且取得所有患者的知情同意書。為了簡化分析，將膠質瘤樣本分為低級別組（WHO I級和II級）和高級別組（WHO III級和IV級）。

1.2 細胞培養和試劑U87、U251細胞系（中科院上海生物科學研究所生物化學和細胞生物學研究所）在含有10%胎牛血清的DMEM培養基（Hy-Clone，UT，USA）中培養，培養箱參數37℃和5% CO2。

1.3 免疫組化檢測PHLDA1的表達取4 μm厚新鮮石蠟切片。兔型抗人PHLDA1抗體（1:400）（產品編號:ab155662），購于Abcam貿易有限公司（上海）；PV-9000兩步免疫組化試劑盒購于中國杉木公司（北京）。實驗步驟均按試劑盒說明書進行。

1.4 RNA提取和qRT-PCR檢測PHLDA1轉錄情況使用RNeasy提取試劑盒（Qiagen，Valencia，CA）從70份組織樣品中提取出總RNA 500 ng。逆轉錄成cDNA。在Rotor-Gene 3000實時機（Corbett Research，Australia）上使用 SYBR PCR擴增試劑盒（Invitrogen公司）進行PCR擴增。使用β-肌動蛋白作為標準化內源參照。PCR擴增條件根據試劑盒說明書。PHLDA1 mRNA表達水平定量分析通過2-△△CT公式計算。PHLDA1引物序列5'-CTCCAAATGAGACCGTG-3'和5'-GCCTGACGAT CTTGTACT-3'。內參序列是5'-CTGGGACGACA TGGAGAAAA-3'。所有試驗至少重復3次。

1.5 RNA干擾與慢病毒載體的制備PHLDA1干擾RNA（siRNA）靶向序列選自基因庫No.BC 025382（GCAGTCAGATTCCAGAAT，GTTG GCATG CAAAGCCAAT和CAACAGAGTCGTTGTGCTG。將寡核苷酸插入到pGCSIL-GFP慢病毒載體（Invit-rogen，USA）中。siRNA干擾序列作為陰性對照。PHLDA1 干擾質粒（Si PHLDA1）：5'-AGGGCGAT GATGTACTGTAA-3'；陰性對照 5'-TTCTCGAACG TGTCACGTCT-3'。

1.6 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽比色法（MTT試驗）評估PHLDA1對膠質瘤細胞活性調節的作用膠質瘤細胞以1×104個/孔的密度接種在96孔板中。試驗組中利用Si PHLDA1孵育，陰性對照組中加入無意義siRNA，然后通過加入10 μL MTT，持續4 h。分別在siRNA處理后 0、24、48、72和 96 h，使用光譜酶標儀 1420（Perkin Elmer，Foster City，CA）測定 570 nm（A 570）處的吸光度。每組試驗重復3次。

1.7 平板克隆試驗評估腫瘤細胞形成集落的能力將被 Si PHLDA1或空質粒對照（PHLDA1 Scr）轉染的U251和U87細胞用胰蛋白酶消化，離心，懸浮于0.4%瓊脂培養基中。用Giemsa染色法（Chemicon and Upstate，Millipore，Billerica，MA）觀察菌落數，并在顯微鏡下計數。

1.8 體外細胞遷移和侵襲試驗將Si PHLDA1或PHLDA1 Scr感染后呈對數周期生長的腫瘤細胞用胰蛋白酶消化并重懸后制成單細胞懸液。將含有1×105個細胞的0.5 mL無血清DMEM或EMEM接種到8 μm孔隙聚碳酸酯膜上，通過用棉簽擦拭除去頂層的細胞。遷移到底部的細胞在100%甲醇中固定2 min，用0.5%結晶紫染色2 min，在磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中漂洗，然后在顯微鏡（×200倍）下觀察和計數。每個膜平均5個視野計算侵入和遷移的腫瘤細胞的數量。每個實驗至少重復3次。

1.9 流式細胞術分析使用改良方案進行流式細胞術測定以評估細胞周期分布。將5×105個細胞接種在100 mm培養皿中。然后用Si PHLDA1或PHLDA1 Scr感染細胞2 d。用1mL碘化丙啶（PI）溶液（含 20 mg/mL PI和20 mg/mL RNase的PBS）染色 3 h后使用流式細胞儀（Beckman-Coulter，Fullerton，CA）分析。用胰蛋白酶消化在6 cm培養皿中培養的細胞，并在室溫避光條件下用FITC偶聯的抗annexin V抗體染色15 min，然后用流式細胞儀（FACSCalibur，BD Biosciences）分析。

2 結果

圖1 PHLDA1在正常腦腦組組標本和星形細胞瘤中的表達（標尺25 μm） A.正常腦組織;B.WHO I級的毛細胞型星形細胞瘤;C.WHO II級彌漫性星形細胞瘤;D.WHO III級間變性星形細胞瘤;E.WHO IV級膠質母細胞瘤;F.WHO IV級膠質母細胞瘤的陰性對照。

表1 不同等級膠質瘤中PHLDA1蛋白的表達

2.2 RNA 干擾 PHLDA1（Si PHLDA1）對膠質瘤細胞增殖侵襲的影響在使用Si PHLDA1，三組腦MTT檢測膠質瘤細胞株U251、U87細胞活性在0 h、24 h 差異均無統計學意義（0 h：FU251=0.352，FU87=0.050；24h：FU251=4.213，FU87=1.821，P 均＞0.05）；RNA干擾組MTT檢測腦膠質瘤細胞株U251、U87細胞活性在 48 h（FU251=41.132，FU87=29.248）、72 h（FU251=32.139，FU87=107.682）、96 h（FU251=13.340，FU87=19.201）明顯低于空白對照組和陰性對照組（P＜0.05），而空白對照組和陰性對照組MTT檢測腦膠質瘤細胞株U251/U87細胞活性在48 h、72 h、96 h 差異無統計學意義（P＞0.05，表 2）。流式細胞術分析顯示，使用Si PHLDA1后，U87和U251細胞凋亡率均高于空白對照組（t1=32.846，P＜0.01；t2=29.763，P＜0.01，圖 2A、2B）。U87 和 U251中干擾組G0-G1期細胞百分比均低于非干擾組（t=6.026/4.508，P＜0.05，表 3，圖 2C），而 U87 和U251中干擾組的S期細胞百分比均高于非干擾組（t=14.441/8.125，P＜0.01，表 3，圖 2C）。平板克隆試驗顯示，Si PHLDA1組的細胞數量明顯低于空白對照組（t1=16.421，P＜0.01；t2=18.476，P＜0.01，圖3A），干擾組的相對遷移率明顯低于空白對照組（t1=26.902，P＜0.01；t2=18.590，P＜0.01，圖 3B）。

圖2 MTT及流式細胞術分析結果所示RNA干擾對于腫瘤細胞增殖率及凋亡率的影響 與空白對照組的S期細胞百分比相比，*P＜0.01。

圖3 平板克隆試驗所示RNA干擾對于腫瘤細胞數量和相對遷移率的影響 與空白對照組比較，*P＜0.01。

表2 RNA干擾細胞株U251及U87在不同時間點的MTT檢測吸光度結果（n=5）

表3 RNA干擾后膠質瘤細胞株流式細胞儀檢測細胞周期的變化（n=3）

3 討論

膠質瘤的主要治療手段包括手術、放療和化療等，均已取得了極大程度的改進。但是，由于膠質瘤具有較強的侵襲能力和對放化療的抵抗能力，造成其臨床治療困難。比如，膠質母細胞瘤（GBM）患者的平均生存時間尚不足18個月[5]。我們迫切需要對膠質瘤發生的分子機制進行深入研究。

PHLDA1廣泛表達于哺乳動物的多種組織器官中，多種因素和細胞因子均可誘發其高表達，提示其參與到機體的多種病理生理過程。研究發現，PHLDA1可參與機體的凋亡、自噬、分化、炎癥反應、脂肪代謝和腫瘤發生發展等一系列生物過程，但其具體生物學作用與刺激因子的類型和組織細胞特異性有關[6]。在臨床樣本和體外研究中發現，PHLDA1表達的異常與癌癥進展息息相關[4，7]。PHLDA1在多種腫瘤的發生發展中發揮著重要作用[7-12]。有報道稱，在乳腺癌、胃腺癌中PHLDA1表達減少，PHLDA1蛋白下調提示乳腺癌患者預后不良，提示PHLDA1具有抑癌作用[7-9]。而在口腔癌及骨肉瘤中PHLDA1表達上調，PHLDA1的高表達與骨肉瘤細胞中的惡性程度相關，PHLDA1在這些腫瘤類型中具有促進腫瘤發生的作用[10-12]。這些研究均表明PHLDA1具有明顯的組織特異性。在本研究中，我們發現，隨著膠質瘤WHO分級的增加，PHLDA1染色強度增加，說明PHLDA1可能影響了膠質瘤細胞的增殖、遷移等生物學特性。生物信息分析研究也表明，PHLDA1基因在膠質瘤中表達上調，其主要參與Notch信號通路的調控進而影響腫瘤的發生，進一步證明了PHLDA1在膠質瘤的發生發展中均發揮著重要作用[13]。進一步的研究發現，長鏈非編碼RNA SNHG1通過競爭性結合miR-194來調控PHLDA1的表達，從而促進膠質瘤的進展[14]。

然而，PHLDA1的確切分子和細胞功能尚未明確，PHLDA1在這些細胞的增殖、分化過程中的具體機制也并不清楚，但實驗研究已經證實其可能扮演著細胞凋亡和增殖的調節劑作用[7]。我們知道腫瘤細胞凋亡增加可以一定程度上抑制腫瘤的進展。本研究發現，干擾PHLDA1后，膠質瘤細胞凋亡率高于對照組，干擾組的G0-G1期細胞比例減少，S期細胞比例增加，存在著明顯的S期阻滯現象。平板克隆試驗顯示，經Si PHLDA1處理后的膠質瘤細胞數量及相對遷移率顯著降低。本研究也進一步證明了PHLDA1可以通過影響凋亡過程進而調節膠質瘤細胞的增殖及侵襲性。然而其對于膠質瘤細胞的具體作用機制，其通過何種通路調節膠質瘤細胞的凋亡，尚需進一步研究。目前關于PHLDA1影響腫瘤細胞凋亡的作用機制也已經開展了相當多的研究。有學者認為，通過干擾PHLDA1可促進半胱天冬酶3（Caspase-3）活化從而誘導腫瘤細胞的凋亡[15]。也有人發現，PKC激活劑可通過PKC激活PHLDA1，進而誘導Fas表達，發揮促凋亡作用[6]。

總之，本研究表明，PHLDA1在膠質瘤中呈過表達。功能分析表明，PHLDA1可能通過影響腫瘤細胞的凋亡過程，在膠質瘤的增殖和侵襲中發揮著重要作用。因此，我們有理由推測PHLDA1可能是神經膠質瘤的新的潛在治療靶點，甚至可以作為一種新型的臨床預后檢測指標，值得臨床上進一步深入研究下去。