冰凍切片免疫組化脫片的研究

浙江大學醫學院附屬第一醫院（310003）彭會貞

冰凍切片是一種在低溫條件下使組織快速冷卻到一定硬度后進行切片的方法[1]。術中冰凍病理檢查可確定腫瘤性質，確定淋巴結是否有轉移等，由于術中冰凍技術的局限性，以及某些腫瘤細胞HE染色形態上的相似性，導致單靠術中冰凍組織HE染色明確診斷困難較大，易漏診誤診，造成患者的二次手術或醫療事故等[2]。免疫組化染色主要用于對不同組織來源腫瘤的鑒別診斷，快速免疫組化應用于術中冰凍，彌補了冰凍病理檢查的不足。但是冰凍切片免疫組化技術還不是很成熟，實驗流程一直在優化，由于冰凍組織是新鮮的，在快速免疫組化的實驗步驟中，冰凍切片很容易脫片，作者經過反復的實驗，摸索出冰凍切片免疫組化不脫片的條件，實驗的流程如下。

1 材料

標本來自于浙江大學醫學院附屬第一醫院病理科的術中冰凍標本，標本類型是肺、甲狀腺、腎、闌尾等；一抗是細胞角蛋白CK，克隆號是AE1/AE3，購自中杉金橋；二抗是酶標羊抗鼠/兔IgG聚合物，購自中衫金橋；阻斷劑是H2O2和甲醇1∶1的混合物；DAB購自leica公司；Buffer緩沖液購自Roche公司；載玻片選用石蠟切片免疫組化專用的TOMO（IHC Adhesive Glass Slide）載玻片。

2 方法

2.1 冰凍切片的制作 隨機選取術中送檢的新鮮組織三塊并標記為A、B、C，A是肺組織，B是肺組織，C是甲狀腺，對三塊組織取完材，用紗布或濾紙吸干表面的液體，將要切取的平面朝下放到冰凍托上面，用OCT包埋，在液氮表面停留約30秒，液氮速凍，然后每塊組織切成厚5um的冰凍切片各2張，冰凍切片用TOMO載玻片貼附，貼片時手要穩，片子分別標記為A1、A2、B1、B2、C1、C2。

2.2 冰凍切片的處理 切完的6張片子分別采用不同的處理方法：①A1、B1、C1片切完迅速放入4%福爾馬林固定液中，固定2min，然后放入全自動冰凍切片染色機進行HE染色，封片；②A2片切完迅速放入4%福爾馬林固定液中，固定2min，然后純水輕柔地沖洗，放入buffer緩沖液中備用；③B2片切完先干燥2min，然后放入4%福爾馬林固定液中固定2min，純水輕柔地沖洗，放入buffer緩沖液中備用；④C2片切完迅速放入4%福爾馬林固定液中，固定2min，然后空氣干燥，完全干燥之后，純水輕柔地沖洗，放入buffer緩沖液中備用。

2.3 快速免疫組化染色

2.3.1 內源性過氧化物酶阻斷 取出切片A2，B2，C2，輕輕擦去多余的buffer緩沖液，然后置于濕盒中，滴加H2O2和甲醇1∶1的混合物室溫放置2min，時間不能太長，太長可能會引起某些抗原的丟失。

2.3.2 孵育一抗 取出切片A2、B2、C2，放入buffer緩沖液中輕輕洗滌30s，輕輕擦去多余的buffer緩沖液，然后置于濕盒中，滴加一抗CK，蓋上蓋子，放入37℃恒溫烤箱中，計時15min。

2.3.3 孵育二抗 取出切片，放入buffer緩沖液中輕輕洗滌30s，輕輕擦去多余的buffer緩沖液，然后置于濕盒中，滴加二抗，蓋上蓋子，放入37℃恒溫烤箱中，計時5min。

2.3.4 滴加DAB 取出切片，放入buffer緩沖液中輕輕洗滌30s，輕輕擦去多余的buffer緩沖液，滴加新鮮配制的DAB液，顯微鏡下控制顯色，顯色完畢的切片放入純水中洗滌。

2.3.5 蘇木精復染，脫水封片 蘇木精復染細胞核，鹽酸酒精分化，返藍液返藍，梯度乙醇脫水，二甲苯脫去乙醇，櫻花全自動封片機封片。

3 結果

肉眼觀察三塊組織A、B、C的脫片情況，顯微鏡下觀察細胞的皺縮情況，如附圖1～3。

附圖2 圖5是B塊組織的冰凍切片HE圖片；圖6是B塊組織的冰凍切片免疫組化圖片，兩者組織大小用肉眼進行對比，組織沒有脫片；圖7是B塊組織冰凍切片HE的細胞圖；圖8是B塊組織冰凍切片免疫組化的細胞圖，顯微鏡下觀察，細胞均無皺縮。

附圖3 圖9是C塊組織的冰凍切片HE圖片；圖10是C塊組織的冰凍切片免疫組化圖片，兩者組織大小用肉眼進行對比，組織沒有脫片；圖11是C塊組織冰凍切片HE的細胞圖；圖12是C塊組織冰凍切片免疫組化的細胞圖，顯微鏡下觀察，細胞均無皺縮。

從上述圖中的特征分析，在冰凍切片免疫組化的實驗步驟中，切完片直接固定然后進行免疫組化染色的，很容易脫片；切完片先干燥2min然后再固定再進行免疫組化染色的，不脫片；切完片先固定再空氣完全干燥切片的，不脫片；細胞都沒有發生皺縮的情況；筆者又在其他的組織類型中，如陰莖、腎、闌尾等進行實驗，得到同樣的實驗結果。

4 討論

快速免疫組化運用于術中冰凍的主要技術要點有：①冰凍切片固定前干燥2min，能夠保證組織不脫片，為什么選擇2min？筆者也實驗過干燥1min和3min，1min部分組織會脫片，3min組織未脫片，但是干燥時間越長細胞越容易皺縮，所以最后摸索出來的時間是2min；②冰凍切片固定完水洗后空氣完全干燥，組織不脫片，筆者也嘗試過組織空氣干燥過程中，等組織半干燥就進行后續的染色，結果未完全干燥的組織很容易脫片，所以才選擇空氣完全干燥組織；③由于切片固定時間較短，不至于導致交聯，所以行快速免疫組化前無需進行抗原修復，為臨床手術爭取時間；④一抗及二抗孵育后的清洗特別關鍵，充分清洗可減少非特異結合引起的背景染色，但是清洗時動作要輕柔，防止組織脫片。

常規的石蠟切片免疫組化技術已經很成熟，但是石蠟切片抗原丟失現象較常見，修復效果有些不理想，而冰凍切片其組織固定時間很短，基本無需微波和高壓等熱修復，制作過程與石蠟切片比較更為快捷、簡便，因此更適合于抗原抗體的免疫組化檢測[3][4]。術中冰凍切片結合快速免疫組化染色可大幅提高術中冰凍切片病理診斷正確性和效率[5]。