PTEN在顱底脊索瘤患者中的表達及其與臨床病理學和預后的關系

田凱兵，王亮，馬駿鵬，王科，張俊廷，吳震

(首都醫科大學附屬北京天壇醫院神經外科，北京 100070)

脊索瘤是一種起源于脊索組織殘余的低度惡性腫瘤，主要發生在骶尾部(29%)和顱底(32%～42%)，發病率為(0.080～0.089)/10萬，患病率男性[(0.100～0.160)/10萬]高于女性[(0.060～0.066)/10萬][1]。脊索瘤對鄰近軟組織有局部侵襲性，對周圍骨骼破壞性明顯。顱底脊索瘤常包繞血管、腦神經等重要結構，患者常出現腦神經功能障礙癥狀，包括頭痛、復視、視力下降、視野缺損、吞咽困難、面癱、感覺障礙等。徹底切除顱底脊索瘤較困難，往往會引起嚴重的并發癥，目前推薦的治療方案為盡可能手術切除輔助術后放療，術后腫瘤進展是困擾患者和神經外科醫師的難題[1-5]。近年來，盡管有突破性的創新方法應用于顱底脊索瘤患者的臨床治療，但對該病分子水平的認識仍不足[6]。人第10號染色體上缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)是一種腫瘤抑制蛋白，在多種惡性腫瘤中表達[7-9]。本課題組前期研究發現PTEN的表達與顱底脊索瘤骨質侵襲程度有關[10]。本研究主要探討PTEN與顱底脊索瘤臨床病理學和預后的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2008年1月至2015年11月在首都醫科大學附屬北京天壇醫院神經外科接受手術治療的顱底脊索瘤患者53例，其中男30例、女23例，年齡11～62歲，平均(39±14)歲；腫瘤直徑18～85 mm，平均(46±14) mm；術前KPS評分40～90分，平均(80±13)分；術中腫瘤侵襲性切除26例，非侵襲性切除27例。隨訪時間3～62個月，無失訪。本組13例患者死亡，36例患者出現術后腫瘤進展，中位PFS 17.83個月，3年無進展生存率為49.50%。首次手術后，22例患者因腫瘤進展再次手術，1例患者再次接受了2次手術，2例患者再次接受3次手術，1例患者由于多次術后腫瘤進展而接受了另外4次手術。

納入標準：①年齡11～62歲；②患者或家屬具備正常溝通、交流能力，配合術后隨訪；③患者及家屬均簽署了知情同意書。排除標準：①合并顱內外其他嚴重疾病，如腦血管病、心肌梗死；②合并其他部位、類型腫瘤者；③存在認知、心理及精神障礙者。所有患者腫瘤石蠟樣本為術中腫瘤取出后30 min內用10%甲醛固定，24 h后將樣本進行石蠟包埋。冰凍組織樣本在術中取出后30 min內儲存于液氮中。腫瘤組織石蠟樣本及冰凍樣本均存放于首都醫科大學附屬北京天壇醫院臨床醫學研究中心。

1.2主要試劑和儀器 封閉用山羊血清(北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：20081901)；PTEN抗體(英國Abcam公司，批號：GR154649-2)；二抗Goat Anti-Rabbit IgG (H+L),HRP Conjugate(北京全式金生物技術有限公司，批號：20020219)；DAB染液(北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：2040A0925)；TRIzol(美國Thermo Fisher Scientific公司，批號：15596018)；帶有gDNA Erase的PrimeScript RT試劑盒(日本Takara公司，批號：AJF1731A)；聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)試劑盒TaqManTMUniversal Master Mix Ⅱ,no UNG(美國Thermo Fisher Scientific公司，批號：4440048)；TaqMan探針(美國Thermo Fisher Scientific公司，PTEN：Hs02621230-g1，GAPDH：Hs02758991-g1)。

包埋儀(EG1150C)、免疫組織化學一體機(ASP，200S)、顯微鏡(DM2000)、切片機(RM2245)[徠卡顯微系統(上海)有限公司]；PCR擴增儀(美國Applied Biosysterms公司，PCR System 9700)；PCR儀(瑞士羅氏公司，LightCyler480 PCR)。

1.3方法

1.3.1PTEN蛋白的檢測 石蠟樣本制作5 μm切片，試驗開始前60 ℃烤片2 h，經過脫蠟、水合，應用檸檬酸鈉進行抗原修復，3% H2O2阻斷內源性過氧化物酶，抗原封閉，一抗(1∶400倍稀釋)4 ℃孵育12 h，二抗(1∶250倍稀釋)室溫孵育1 h，DAB染液顯色，復染后脫水、透明、封片[11]。

每例樣本由兩位病理科醫師分別隨機評估400倍鏡下的陽性率及染色強度，依據染色強度、染色百分率進行評分。染色強度評分：0(無染色)，1(染色弱)，2(中等染色)，3(強染色)。染色百分率評分：0(0%)，1(<20%)，2(20%～50%)，3(>50%)。染色強度和百分率評分之和為最終評分，最終評分0～2分定義為低表達，3～6分定義為高表達[11]。

1.3.2PTEN基因的檢測 采用TRIzol提取mRNA，20 mg組織添加1 mL TRIzol，步驟如下：研磨組織制作組織勻漿，加TRIzol室溫放置10 min，4 ℃下12 000 ×g離心5 min，取上清液加入氯仿(1 mL TRIzol加入200 μL氯仿)，4 ℃下12 000×g離心15 min，取上層水相加入異丙醇(1 mL TRIzol加入0.5 mL異丙醇)室溫放置10 min，4 ℃下12 000×g離心10 min，棄去上清液，75%乙醇(1 mL TRIzol加入1 mL 75%乙醇)洗滌RNA，4 ℃下7 000×g離心5 min，棄去上清液，晾干5～10 min，無菌純水溶解。

使用帶有gDNA Erase的PrimeScript RT試劑盒依據說明書進行逆轉錄反應，依據說明書配置溶液后置于PCR擴增儀去除組織DNA并逆轉錄。使用TaqManTMUniversal Master Mix Ⅱ,no UNG實時定量PCR試劑盒，TaqMan探針法進行實時定量PCR反應。靶片段在10 μL系統中擴增。反應過程如下：95 ℃ 10 min，40個循環：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s。結果取每個樣本2-ΔΔCT值代表PTEN基因表達水平進行分析[12]，腫瘤2-ΔΔCT值高代表腫瘤中PTEN表達水平高，樣本2-ΔΔCT值計算過程如下：ΔCT=CTPTEN-CTGAPDH；2-ΔΔCT=2-(ΔCT-ΔCT所有樣本均數)。

1.4臨床評價 收集患者的臨床資料，包括性別、年齡、術前KPS評分、腫瘤直徑、侵襲類型、分期、分隔、質地、切除方式、病理類型。其中腫瘤質地分為軟和硬(后者包括軟韌不均成分的腫瘤)，腫瘤分隔分為瘤內無纖維分隔和有纖維分隔。隨訪主要在門診患者中進行，對少數不能就診的患者采用電話隨訪。所有組織學標本均由至少兩名有5年以上脊索瘤分析經驗的病理學醫師觀察，根據國際癌癥研究機構分型進行病理分型(包括經典型、軟骨樣型和未分化型，本研究樣本中無未分化型)[13]。所有磁共振成像影像資料由兩位具備5年以上顱底腫瘤診斷經驗的放射科醫師使用影像存檔與通信系統進行評估：記錄腫瘤直徑；侵襲性分為骨侵襲性(侵犯周圍骨)和非骨侵襲性；分期根據是否存在硬腦膜破壞而定；切除方式包括侵襲性切除(切除程度>90%)和非侵襲性切除(切除程度≤90%)。術后腫瘤進展定義為殘余腫瘤再生長或復發。分析患者PTEN蛋白、PTEN基因表達水平與以上臨床病理學及無進展生存期(progression-free survival，PFS)的關系。

2 結 果

2.1PTEN蛋白表達結果 PTEN主要分布于基質、細胞質和細胞核，PTEN蛋白低表達26例，高表達27例。PTEN蛋白高表達與低表達者的年齡、術前KPS評分、腫瘤直徑比較差異無統計學意義[(34±15)歲比(38±14)歲,t=1.207,P=0.233；80(70,90)分比75(70,80)分，Z=-1.156,P=0.248；(43±16) mm比(48±10) mm,t=1.309,P=0.196]。Kaplan-Meier分析結果顯示，PTEN蛋白低表達者術后PFS較高表達者顯著縮短[(9.00±1.91)個月比(35.00±3.18)個月](P<0.05)。見圖1。

PTEN：人第10號染色體上缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物

PTEN蛋白表達在顱底脊索瘤患者不同性別、分期、分隔、切除方式及病理類型方面差異無統計學意義(P>0.05)；但PTEN蛋白表達在不同侵襲類型、質地方面差異有統計學意義(P<0.05)，非骨質侵襲腫瘤中PTEN蛋白高表達率低于骨質侵襲腫瘤，質地軟的腫瘤中PTEN高表達率高于質地硬的腫瘤(P<0.05)。見表1、圖2。

表1 顱底脊索瘤PTEN蛋白表達結果 [例(%)]

2.2PTEN基因表達結果 PTEN基因的表達水平與患者年齡、腫瘤直徑、術前KPS評分無關性(r=-0.210，P=0.128；r=0.080，P=0.554；r=-0.070，P=0.643)；不同性別、侵襲類型、分期、分隔、質地、切除方式、病理類型間PTEN基因表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 顱底脊索瘤患者PTEN基因表達結果

3 討 論

脊索瘤是一種少見的慢性低度惡性腫瘤，以骶尾部和顱底較常見。脊索瘤多呈浸潤性生長，對周圍骨組織破壞嚴重，術后易復發，患者遠期預后差，給臨床治療帶來很大挑戰[1]。目前尚無針對脊索瘤的有效藥物治療方案，為明確相關作用因子和通路，包含較多樣本的蛋白質、基因水平的研究亟待開展，本研究基于前期研究結果，著重探討在顱底脊索瘤中PTEN的蛋白和基因表達水平。

2a:骨侵襲腫瘤，染色較淺，陽性細胞多，陽性部位主要位于胞質和細胞間基質；2b:非骨侵襲腫瘤，染色深，可見陽性細胞核，所有腫瘤細胞染色；2c:質地軟的腫瘤，在細胞質和細胞間基質中呈強陽性染色；2d:質地硬的腫瘤，染色較淺，偶見陽性染色；PTEN：人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物

PTEN是一種常見的腫瘤抑制基因，其翻譯產物 PTEN蛋白在細胞脂質信號磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸的去磷酸化過程中起作用，影響細胞生長、增殖和分化等過程。此外，PTEN抑制其他途徑，如哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)激酶靶點調節細胞生長，也可部分調節磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)活性[14]。PTEN在多種腫瘤中發揮作用，包括前列腺癌、乳腺癌、膠質瘤、胰腺黏液性非腫瘤性囊腫和骨髓相關腫瘤[15-16]。近年來，脊索瘤中也有PTEN表達的報道[17-18]。本研究結果證實，PTEN蛋白與腫瘤骨質侵襲性和質地及PFS顯著相關，PTEN基因與患者臨床病理學及PFS無相關性，提示在顱底脊索瘤中PTEN發揮作用主要通過其蛋白表達調控而非基因表達。

PTEN蛋白低表達與腫瘤的侵襲性相關。Lee等[14]研究證實脊索瘤中PTEN雜合性缺失可導致脊索瘤細胞侵襲性增加，本研究結果與本課題組前期研究結果一致[10]，PTEN蛋白表達與顱底脊索瘤骨質侵襲性相關。研究發現，PTEN無表達和mTOR表達與骶尾部脊索瘤侵襲性及臨床預后相關[11]。另外，Wang等[19]發現PI3K/蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt)在PTEN減少的乳腺癌腋窩淋巴結轉移中被激活，推測PI3K/Akt通路的激活與腫瘤的侵襲和遷移有關。Puzio-Kuter等[20]研究證實，mTOR通路在前列腺癌的侵襲性中起重要作用。由此推斷，PTEN也可通過調節PI3K/Akt/mTOR通路間接調控顱底脊索瘤的侵襲性，腫瘤中PTEN高表達，PI3K/Akt/mTOR通路受到抑制，腫瘤對周圍骨質侵襲能力增強，而腫瘤中PTEN低表達PI3K/Akt/mTOR通路激活，導致腫瘤侵襲能力減弱。

雖然PTEN表達與腫瘤組織質地的關系較少見報道，但本研究結果顯示，質地軟的PTEN蛋白高表達率高于質地硬的腫瘤。而本課題組前期研究證實腫瘤質地是影響患者術后PFS的潛在風險因素，質地軟的腫瘤患者PFS較質地硬的腫瘤患者更長[21]，其原因可能是質地軟的腫瘤中PTEN蛋白高表達，導致腫瘤增殖較質地硬的腫瘤慢而PFS延長。不同質地腫瘤中PTEN蛋白表達差異的原因可能是質地軟的腫瘤中PTEN蛋白高表達，對周圍骨質侵襲性高，腫瘤內骨質侵襲完全而腫瘤質地軟；而質地硬的腫瘤中PTEN蛋白表達水平低，對周圍骨質的侵襲性弱，骨質破壞不全導致腫瘤內部骨性成分多而質地偏硬。

另外，PTEN蛋白低表達可促進腫瘤細胞增殖。Yang等[18]對脊柱脊索瘤中PTEN表達的研究發現，PTEN低表達患者術后PFS和生存期均顯著縮短。Lee等[14]發現脊索瘤中PTEN雜合性缺失導致PTEN腫瘤抑制作用下降，而細胞增殖加快。本研究結果與上述研究結果一致，顱底脊索瘤PTEN蛋白低表達者PFS顯著縮短，術后腫瘤進展風險增加，即PTEN在顱底脊索瘤中的表達降低可能促進腫瘤細胞增殖。關于PTEN抑制脊索瘤細胞增殖的分子機制較少見報道，Michmerhuizen等[22]研究發現，PI3K/Akt/mTOR通路抑制劑可抑制細胞生長、增殖并促進其凋亡，而PTEN是針對該通路的抑癌基因，由此推斷，顱底脊索瘤中PTEN低表達可降低對PI3K/Akt/mTOR通路的抑制作用，減弱對細胞生長、增殖的抑制作用、減少凋亡，進而加速腫瘤進展。

本研究結果表明，PTEN蛋白在顱底脊索瘤中的表達與腫瘤骨質侵襲性、質地及腫瘤進展相關，而骨質侵襲性、腫瘤進展是顱底脊索瘤的重要特性，因此進一步研究PTEN在顱底脊索瘤中發揮作用的分子機制具有重要臨床意義。但本研究也存在不足之處，納入例數較少，PTEN在顱底脊索瘤中更多的作用及相關機制仍需進一步探討。

綜上所述，非骨質侵襲腫瘤中PTEN蛋白高表達率低，質地軟的腫瘤PTEN蛋白高表達率高，PTEN蛋白低表達的顱底脊索瘤患者PFS顯著縮短。