二甲雙胍-白藜蘆醇復合物油包水型納米乳在體腸吸收及其藥代動力學研究

陳 云，曾 梅，徐靖鑫，胡 娟，張景勍*

（1重慶醫科大學藥學院重慶高校藥物工程研究中心，重慶400016；2重慶華邦制藥有限公司，重慶401121）

2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是一種綜合代謝性疾病，由胰腺β細胞功能障礙或胰島素抵抗引起，與心腦血管疾病、慢性腎病等疾病密切相關［1］。目前，全世界約有9.1%的成年人患有糖尿病，其中90%為T2DM，而亞洲是T2DM發病率最高的地區［2］。二甲雙胍（metformin，MET）是臨床治療T2DM的首選口服藥物，具有有效、安全和耐受性較好的特點［3-4］。白藜蘆醇（resveratrol，RES）是一種天然植物多酚，具有抗氧化、抗糖尿病、抗炎和神經保護等藥理作用［5-6］。雖然白藜蘆醇在臨床上有效治療T2DM的證據仍不夠充分，但研究證明白藜蘆醇可改善T2DM患者心腦血管功能及相關并發癥［7-9］。二甲雙胍因具有高溶解性、低滲透性的特點，所以口服腸道吸收差、生物利用度低［10-11］，改善其腸道吸收，增加其口服生物利用度具有重要意義。

具有良好生物相容性的兩親性物質磷脂是目前制備仿生制劑的常用材料，與藥物制備成復合物被認為是提高藥物溶解度和膜通透性的有效方法［12］。環糊精具有親水性外表面和親脂性中心空腔，與不同相對分子質量的藥物制備成包合物可改善藥物溶解度和釋放特性［13］。本課題組之前的研究已經證明了將藥物制備成磷脂-環糊精復合物可以改善藥物的腸道吸收和藥代動力學特性［14-15］。納米乳因其較小粒徑所賦予的高比表面積，相比其他劑型具有較快的吸收速率和較好的穩定性［16］。將二甲雙胍和白藜蘆醇制備成磷脂-環糊精復合物，進一步制備成油包水納米乳（metformin resveratrol compound water-in-oil nanoemulsion，MRCE）以期提高二甲雙胍的腸道吸收和口服生物利用度。本研究考察了MRCE大鼠在體腸吸收情況和藥代動力學特點，為進一步開發治療T2DM及其并發癥的口服制劑奠定基礎。

1 材料

1.1 藥品與試劑

二甲雙胍（純度大于99.0%，武漢遠城科技發展有限公司）；白藜蘆醇（純度大于99.0%，江西本草天工科技有限責任公司）；磷脂（德國A.Natter?mann＆Cie.GmbH公司）；甲基β環糊精（山東淄博千匯科技有限公司）；癸酸鈉（上海禾午生物科技有限公司）；殼寡糖（浙江金殼藥業股份有限公司）；透明質酸（曲阜市廣龍生物制品廠）；單辛酸甘油酯（河南正通食品科技有限公司）；聚氧乙烯蓖麻油（德國BASF公司）；PEG400（天津市廣福精細化工有限公司）；乙腈、甲醇等試劑均為色譜純，實驗用水均為超純水。

1.2 儀器

LC-20A高效液相色譜儀（日本島津公司）；G-16高速臺式離心機（北京白洋器械有限公司）；RE-52AA型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；PHS-3CpH計、DDS-307A型電導率儀（上海儀電科學儀器股份公司）；FD-V3旋光儀（上海儀邁儀器科技有限公司）；FA1004A電子天平（上海精天電子儀器有限公司）。

1.3 動物

清潔級SD大鼠，體重為（230±20）g，雄性，由重慶醫科大學動物實驗中心所提供，合格證編號：SCXK-（渝）2018-0001。所有動物實驗均符合動物倫理委員會標準。

2 方法

2.1 MRCE的制備

稱取二甲雙胍60 mg、白藜蘆醇30 mg、磷脂196.74 mg和甲基β環糊精557.36 mg，于50 mL圓底燒瓶，溶于無水乙醇20 mL中，置于40℃水浴中磁力攪拌2 h。40℃條件下旋轉蒸發30 min（真空度為0.08 MPa）除去無水乙醇，真空干燥即得復合物A。采用加水滴定法制備MRCE。稱取復合物A 70.72 mg、單辛酸甘油酯0.6 g、PEG400 1.3 g、聚氧乙烯蓖麻油1.3 g，40℃恒溫水浴使全部溶解，在40℃磁力攪拌條件下逐滴加入殼寡糖和透明質酸混合溶液（10∶1）300μL，6%的癸酸鈉水溶液500μL，超聲除去氣泡，即得MRCE。

2.2 MRCE的表征

取1 mg/mL MRCE溶液適量，分別用pH計、電導率儀和旋光度儀測定MRCE的pH、電導率和旋光度，平行測定3次。

2.3 大鼠在體腸吸收實驗

2.3.1 色譜條件 C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相：乙腈-磷酸二氫銨（35∶65）；流速：l.0 mL/min；柱溫：30℃；進樣體積：20μL；檢測波長：238 nm。

2.3.2 腸液樣品的處理方法及專屬性 分別取待測樣品，K-R循環液和甲醇0.1 mL，渦旋3 min充分混勻，以12 000 r/min離心10 min后，吸取上清液按照“2.3.1”項下色譜條件進樣分析。取空白K-R循環液，空白K-R循環液、二甲雙胍和白藜蘆醇的混合物以及腸液樣品，同法處理并進樣分析，考察方法的專屬性。

2.3.3 線性和檢測限 取空白K-R循環液（0.1 mL），加入系列質量濃度的二甲雙胍對照品溶液，得到含二甲雙胍質量濃度范圍為1~40μg/mL的樣品，按照“2.3.2”項下方法處理，在“2.3.1”項下色譜條件下測定各樣品中的二甲雙胍的峰面積。以二甲雙胍峰面積（A）與二甲雙胍質量濃度（c）進行線性回歸，得到二甲雙胍的回歸方程。取空白K-R循環液和稀釋后的二甲雙胍溶液，按照“2.3.2”項下方法處理，在“2.3.1”項下色譜條件下進樣分析，按信噪比（S/N）3∶1確定二甲雙胍的檢測限。

2.3.4 重復性 分別制備含二甲雙胍的1，20，40 μg/mL的腸液樣品，平行配制3份，按照“2.3.2”項下進行處理后，在“2.3.1”項下色譜條件下進樣，同1 d內連續進樣5次檢測，連續5 d進行檢測，考察其日內精密度及日間精密度。

2.3.5 回收率 按“2.3.4”項下配制相同樣品并處理后，同法進樣，測定得到二甲雙胍的質量濃度（c1）。同時進樣測定相應質量濃度的二甲雙胍對照品溶液，得到二甲雙胍的質量濃度（c0），以c1/c0之比計算MRCE的回收率。

2.3.6 單向腸灌流模型 12只雄性SD大鼠，隨機分2組，實驗前禁食24 h，不禁水。水合氯醛麻醉（10 mL/kg），固定后沿腹中線剪開腹腔，剝離出十二指腸、空腸、回腸和結腸，分離各腸段約10 cm，將硅膠管插入每個腸段的兩端并結扎，連通蠕動泵。通過蠕動泵先用37℃的0.9%NaCl溶液將腸道內容物沖洗干凈，采用K-R溶液以流速為0.4 mL/min平衡10 min后，灌流二甲雙胍溶液（100μg/mL，0.2 mL/min）或MRCE混懸液（含等量二甲雙胍）60 min，收集灌流液，最后用空白K-R循環液沖洗腸段，與灌流液合并，轉移至25 mL容量瓶定容，-4℃條件下保存待測［17］。

2.3.7 數據處理 實驗完成后處死大鼠，測量各個腸段的內徑和長度。按照“2.3.1”項下色譜條件進樣，檢測二甲雙胍的質量濃度，再根據公式［17］計算在各腸段游離二甲雙胍和MRCE的吸收速率常數（Ka）、有效滲透系數（Peff）和吸收百分率（PA）。

2.4 大鼠藥代動力學

2.4.1 血漿樣品的處理方法 取待測血漿樣品0.1 mL，加入甲醇0.5 mL后渦旋3 min充分混勻，以12 000 r/min離心10 min后，按一定比例吸取上清液并用氮氣揮干有機相，甲醇0.1 mL復溶，再次以12 000 r/min離心5 min后，取上清液0.02 mL進樣分析，按照“2.3.1”項下色譜條件進樣檢測二甲雙胍的質量濃度。取空白血漿，空白血漿、二甲雙胍和白藜蘆醇的混合物以及血漿樣品，同法處理并進樣分析，考察方法的專屬性。

2.4.2 線性和檢測限 取空白血漿（0.1 mL），加入系列質量濃度的二甲雙胍對照品溶液，得到含二甲雙胍質量濃度范圍為100~10 000 ng/mL的樣品，按照“2.4.1”項下方法處理，在“2.3.1”項下色譜條件下測定各樣品中的二甲雙胍的峰面積。以二甲雙胍峰面積（A）與二甲雙胍質量濃度（c）進行線性回歸，得到二甲雙胍的回歸方程。取空白血漿和稀釋后的二甲雙胍溶液，按照“2.4.1”項下方法處理，在“2.3.1”項下色譜條件下進樣分析，按S/N=3∶1確定二甲雙胍的檢測限。

2.4.3 重復性 分別制備含二甲雙胍100，1 000，10 000 ng/mL的血漿樣品，平行配制3份，按照“2.4.1”項下進行血漿樣品處理后，在“2.3.1”項下色譜條件下進樣，同1 d內連續進樣5次檢測，連續5 d進行檢測，考察其日內精密度及日間精密度。

2.4.4 回收率 按“2.4.3”項下配制相同樣品并處理后，同法進樣，測定得到二甲雙胍的峰面積（A1）。同時進樣測定相應質量濃度的二甲雙胍對照品溶液，得到二甲雙胍的峰面積（A2），以A1/A2峰面積之比計算MRCE的回收率。

2.4.5 給藥方案與數據處理 12只雄性大鼠隨機分為兩組，實驗前12 h內禁食不禁水，分別灌胃給予二甲雙胍和MRCE（60 mg/kg），在預定時間點（0.08，0.16，0.25，0.5，0.75，1，2，5，8，12，24，48，72 h）從眼眶后靜脈叢采集血樣（約0.5 mL），-20℃條件下保存待測［18］。根據測得的血藥濃度繪制血藥濃度-時間曲線，使用DAS2.1.1軟件對數據進行計算分析。計算二甲雙胍和MRCE的藥代動力學參數，生物利用度和生物等效性。

2.4.6 統計學分析 所有數據均以xˉ±s表示，血藥濃度-時間曲線下面積（AUC0-72h）和峰質量濃度（cmax）采用方差分析，雙向單側t檢驗，90%置信區間，達峰時間（tmax）采用非參數統計Wilcoxon檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 制劑表征

經考察，MRCE的pH為6.08±0.08，電導率為19.83±0.05μs/cm，比 旋 度為128.88±0.06。

3.2 大鼠腸液中二甲雙胍含量測定方法

Figure 1 HPLC chromatogram of metformin(MET)and resveratrol(RES)

在“2.3.1”項下色譜條件下，二甲雙胍和白藜蘆醇的保留時間分別為10.5 min和5.2 min，二甲雙胍與白藜蘆醇峰形良好，且沒有干擾（見圖1）。二甲雙胍的標準曲線方程為：A=100 260.47c-27 337.94，r=0.999 5，線性良好。二甲雙胍的檢測限為20 ng/mL。二甲雙胍低、中、高3種質量濃度日內精密度的RSD（%）分別為1.07、1.82和1.21，日間精密度的RSD（%）分別為2.74、1.86和1.44。二甲雙胍低、中、高3種質量濃度的回收率分別 為（97.58±0.91）%、（96.74±0.49）%和（99.27±1.59）%，RSD（%）分別為0.94、0.51和1.60，專屬性、線性、精密度和回收率的實驗結果均符合要求，表明該含量測定方法合理可行。

3.3 大鼠在體腸吸收實驗

如表1所示，MRCE在十二指腸、空腸、回腸和結腸的Ka、Peff和PA均顯著優于游離二甲雙胍（P<0.05）。MRCE在十二指腸、空腸、回腸和結腸的Ka分別是二甲雙胍在各腸段的7.56、3.13、2.83和1.81倍；MRCE在十二指腸、空腸、回腸和結腸的Peff分別是二甲雙胍在各腸段的9.81、3.59、3.24和1.94倍；MRCE在十二指腸、空腸、回腸和結腸的PA分別是二甲雙胍在各腸段的8.36、3.13、2.83和1.81倍。MRCE在4個腸段中，Ka從大到小依次為：回腸、空腸、十二指腸、結腸；Peff從大到小依次為：回腸、空腸、十二指腸、結腸；PA從大到小依次為：回腸、空腸、十二指腸、結腸，說明MRCE在回腸吸收最好。

Table 1 Absorption rate constant(K a),the effective permeability(P eff)and thepercentage of absorption(PA)of MET and metformin-resveratrol com?pound water-in-oil nano emulsion(MRCE)in rats(xˉ±s,n=6)

3.4 大鼠藥代動力學實驗

3.4.1 血漿樣品二甲雙胍含量測定方法 在“2.3.1”項下色譜條件下，二甲雙胍和白藜蘆醇的保留時間為10.8 min和5.2 min，峰形良好且血漿內源性物質不干擾測定。以二甲雙胍的峰面積為縱坐標（A），二甲雙胍質量濃度為橫坐標（c）建立二甲雙胍的回歸方程：A=31.65c+625.2（r=0.999 5），線性良好。二甲雙胍的檢測限為50 ng/mL。低、中、高質量濃度的二甲雙胍的日內精密度的相對標準偏差（%）分別為3.45，2.59和4.23；二甲雙胍的日間精密度的相對標準偏差（%）為3.71，3.49和4.02；低、中、高質量濃度二甲雙胍的回收率（%）分別為90.12±0.86，89.79±1.16和90.56±0.88，RSD（%）分別為1.17，1.59和1.19。專屬性、線性、精密度和回收率的實驗結果均符合要求，表明該含量測定方法合理可行。

3.4.2 血藥濃度-時間曲線曲線 以時間為橫坐標，二甲雙胍平均血藥濃度為縱坐標，繪制得到MRCE和游離二甲雙胍的血藥濃度-時間曲線。由圖2可知：游離二甲雙胍在灌胃給藥后約1.3 h達到了峰質量濃度（cmax），然后血藥濃度在8 h內快速降低，而MRCE在大鼠灌胃給藥后，約1 h達到cmax，而后在96 h內緩慢下降。

Figure 2 Plasma concentration-time profiles of MET in rats after intragastric administration of METand MRCEat METdose of 60 mg/kg(xˉ±s,n=6)

3.4.3 藥代動力學參數 經DAS 2.1.1軟件計算分析，二甲雙胍和MRCE的主要藥代動力學參數符合非房室模型，結果見表2。MRCE的cmax較二甲雙胍降低了約52.60%（P<0.05），而tmax較二甲雙胍縮短了約24.81%（P<0.05），MRCE藥效降低了，但在體內起效時間更快；MRCE的半衰期（t1/2）和平均滯留時間（MRT0-72h）分別約為二甲雙胍的11.25倍和6.97倍，MRCE的消除率（CL）相較于二甲雙胍約降低了約44.63%，這些藥代動力學參數的改變說明MRCE在體內滯留時間更長，消除得更慢；MRCE的血藥濃度-時間曲線下面積（AUC0-72h）約為游離二甲雙胍的1.7倍，MRCE的相對生物用度為167.6%，說明MRCE可提高二甲雙胍的口服生物利用度。

Table 2 Main pharmacokinetic parameters calculated as non-com?partment model after intragastric administration of MET and MRCE at METdose of 60 mg/kg(xˉ±s,n=6)

3.4.4 生物等效性 經DAS2.1.1軟件計算分析后所得的生物等效性結果見表3。AUC0-72h和cmax的90%可置信區間均不在等效區間內，MRCE與游離二甲雙胍的tmax經非參數Wilcoxon檢驗后，差異具有統計學意義（P<0.05）。綜上所述，MRCE與游離二甲雙胍生物不等效，MRCE的藥代動力學行為優于二甲雙胍。

Table 3 Bioequivalence comparison of MET and MRCE after intra?gastric administration(xˉ±s,n=6)

4 討 論

近年來，二甲雙胍的制劑研究更偏向于探究治療腫瘤的潛力或改變二甲雙胍的給藥方式，關于改善二甲雙胍口服生物利用度的報道較少。Manconi等［19］制備了二甲雙胍殼聚糖脂質體，大鼠灌胃給藥（含等量二甲雙胍200～300 mg/kg）后，AUC0-∞提高了40%；Li等［20］制備了二甲雙胍油包水納米乳，大鼠灌胃給藥（含等量二甲雙胍100 mg/kg）后，結果顯示與游離二甲雙胍相比AUC0-∞提高了66.97%。

二甲雙胍的動力學特點是吸收緩慢，不完全吸收［21］，延長其在體內的滯留時間有助于更好地發揮療效。本研究首先采用捏合法制備了二甲雙胍和白藜蘆醇的磷脂-環糊精復合物，磷脂-環糊精復合物能更有效地避免快速清除（例如腎小球過濾、單核吞噬細胞系統識別和脾或肝的物理清除），從而顯示更長的血液循環時間［14］。采取加水滴定法制備了MRCE，將磷脂-環糊精復合物制備成油包水乳劑進一步延緩藥物釋放。油包水型納米乳劑的油相可以保護生物活性成分免受外界因素（例如氧化、pH或水解）的影響。口服納米乳劑可能會刺激多種脂質傳感機制，進而引起胃、胰脂肪酶和膽汁鹽的分泌。在胃腸腔中釋放的藥物以納米形式沉淀或摻入由釋放的油分或可利用的膽汁鹽形成的混合膠束中，使得藥物胃滯留時間延長［22］。藥代動力學實驗結果顯示，大鼠灌胃給藥（含等量二甲雙胍60 mg/kg）后，MRCE的AUC0-72h和AUC0-∞較游離二甲雙胍分別提高了67.6%和84.1%，MRCE的相對生物利用度為167.6%，MRCE給藥劑量更小，且生物利用度提高更加顯著。而MRCE的t1/2和MRT0-72h分別是游離二甲雙胍的11.25倍和6.97倍，MRCE的CL降低了44.6%。這些數據說明了MRCE比游離二甲雙胍作用時間更長，更不易被消除。

在體腸吸收實驗結果顯示，MRCE顯著改善了二甲雙胍在各腸段的吸收特性，主要吸收部位在回腸，其原因可能是回腸的淋巴循環遠高于其他腸段，而淋巴循環是W/O微乳或W/O乳劑的主要運輸方式［20］，藥物通過淋巴循環可減少首過效應的影響。

本實驗結果證明，MRCE能夠促進二甲雙胍在腸道的吸收，改善二甲雙胍在體內的藥代動力學行為，有效提高二甲雙胍的口服生物利用度，初步顯示出作為二甲雙胍口服給藥載體的潛力。