胰島素和油酸促進結腸癌皮下移植瘤生長的代謝組學研究

張 穎，王 笛，張 培，張尊建，許風國

（中國藥科大學藥物質量與安全預警教育部重點實驗室，南京210009）

結腸癌是一種常見的惡性腫瘤，具有較高的疾病發(fā)生率和病死率［1］。據(jù)WHO統(tǒng)計，2020年全球新增結腸癌病例193萬，死亡病例超過90萬（https：//gco.iarc.fr/today/home）。流行病學研究表明糖尿病［2］、肥胖［3］等是結腸癌的重要風險因素，與結腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關。胰島素［4］和脂肪酸代謝異常［5］可能是糖尿病和肥胖介導結腸癌發(fā)展的重要途徑。Chen等［4］研究發(fā)現(xiàn)胰島素可通過上調ACAT1的表達促進結腸癌細胞的增殖和遷移，而脂肪酸代謝異常（如油酸）可通過調節(jié)腫瘤增殖及侵襲相關蛋白的表達介導腫瘤發(fā)生［6-7］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，胰島素和油酸聯(lián)用可以協(xié)同促進結腸癌細胞HCT116的增殖和遷移。綜上，胰島素和油酸均可以在一定程度上促進結腸癌的發(fā)生發(fā)展，但二者對結腸癌代謝輪廓的影響尚不明確。因此，本研究從小分子代謝物角度出發(fā)，對胰島素和油酸給藥后HCT116細胞皮下移植瘤裸鼠血清樣本進行非目標代謝組學研究，旨在尋找差異代謝物并為結腸癌的臨床診治提供理論參考。

1 材料

1.1 試劑及藥品

N-甲基-N-（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（MSTFA，含量大于99.9%）、鹽酸甲氧胺（MOX，含量大于99.9%）及吡啶（美國Sigma-Aldrich公司）；甲醇、乙腈及乙酸乙酯（色譜純）（德國Merk公司）。精蛋白生物合成人胰島素注射液（預混30R）［諾和諾德（中國）制藥有限公司］；油酸（分析純，上海易恩化學技術有限公司）；其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀器

GC/MS-QP2010 Ultra氣質聯(lián)用儀、UFLC-ITTOF/MS液質聯(lián)用儀（日本島津公司）；CentriVap?離心濃縮儀（美國Labconco公司）；TMS-200恒溫混勻儀（杭州奧盛儀器有限公司）；5430R冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；Milli-Q純水制備系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

1.3 細胞株及動物

人結腸癌細胞HCT116購自南京宏新生物科技有限公司，經(jīng)上海翼和應用生物技術有限公司鑒定，樣品編號20191106-01。SPF級雄性BALB/c Nude裸鼠24只，5周齡，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。所有動物實驗均經(jīng)中國藥科大學倫理委員會批準，操作規(guī)程符合動物保護與使用要求，實驗動物使用許可證號：SYXK（蘇）2021-0011。

2 方法

2.1 裸鼠皮下移植瘤模型的建立

動物自購進后于SPF級環(huán)境飼養(yǎng)5～7 d以適應實驗環(huán)境，期間自由飲食，維持環(huán)境溫度為（24±2）℃以及12 h/12 h晝夜循環(huán)。

常規(guī)培養(yǎng)人結腸癌細胞HCT116，收集對數(shù)生長期細胞，并以無血清培養(yǎng)基重懸，調整細胞密度為每毫升5×107個，置于冰上備用。無菌條件下，采用1 mL注射器吸取HCT116細胞懸液0.2 mL注射于每只裸鼠腋窩皮下組織，注射完畢后，裸鼠自由飼養(yǎng)，待細胞定植后開展后續(xù)實驗。

2.2 動物分組及給藥

所有實驗動物隨機分為4組，每組6只，分別為對照組（CON）、胰島素單獨給藥組（INS）、油酸單獨給藥組（OA）、胰島素及油酸聯(lián)合給藥組（IO）。對照組給予空白溶媒；INS組給予胰島素；OA組給予油酸；IO組均同時給予胰島素和油酸。另外，為防止胰島素引起的低血糖，INS和IO組均給予10%葡萄糖水溶液替代飲水。胰島素以每日2.5 U/kg的劑量皮下注射方式給藥；油酸以每日2.0 g/kg的劑量灌胃給藥。首先進行為期10 d的預給藥處理以營造高胰島素和高油酸內環(huán)境，模擬2型糖尿病病理環(huán)境。10 d預給藥結束后暫停給藥，于第11天皮下注射HCT116細胞，建立裸鼠移植瘤模型。隨后進行為期6 d的細胞定植，待細胞定植成功且移植瘤生長到體積為100 mm3左右時繼續(xù)給藥。對照組、INS組、OA組以及IO組給藥方式如前。待平均腫瘤體積達到1 000 mm3左右時處死動物，取血清樣本進行非目標代謝組學分析。

2.3 非目標代謝組學分析

2.3.1 樣品前處理

LC-MS樣品前處理：4℃解凍血清樣品，渦旋后取20μL，加入含5μg/mL格列本脲（內標）的乙腈溶液100μL沉淀蛋白，渦旋，4℃，14 000 r/min，離心10 min，吸取上清液，以相同的條件再次離心，取上清液于進樣小瓶，待LC-MS分析。

GC-MS樣品前處理：4℃解凍血清樣品，渦旋后取10μL，加入含10μg/mL十七酸（內標）的甲醇溶液100μL，渦旋5 min，4℃，14 000 r/min離心2次，每次10min，取上清液80μL。在上清液中加入10 mg/mL MOX溶液25μL，渦旋1 min，37℃振蕩反應1.5 h，50℃真空干燥2 h，加入MSTFA-乙酸乙酯（1∶4）溶液120μL，渦旋1 min，37℃振蕩反應2 h，將反應產(chǎn)物轉移至進樣小瓶，待GC-MS分析。

質量控制樣本（QC）制備：從每份待測樣本中取相同體積血清，混勻，作為QC樣本。QC樣本前處理方式與其他待測樣本一致。儀器分析時，每4～6個待測樣本插入1個QC樣本，監(jiān)測儀器和分析方法的可靠性。

2.3.2 LC-MS及GC-MS分析

LC-MS分析：色譜柱為Phenomenex Kinetex C18（100 mm×2.1 mm，2.6μm）；流動相A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈；流速為0.4 mL/min；梯度洗脫（0～20 min，95%～5%A；20～23 min，5%A；23～30 min，95%A）；柱溫：40℃；進樣器溫度：4℃；進樣量：5μL。離子源為電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI）；正、負離子模式同時采集數(shù)據(jù)，質量掃描范圍：m/z100～1 000；檢測電壓：1.8 kV；離子源接口電壓：正極4.5 kV，負極-3.5 kV；加熱模塊（heat block）溫度：200℃；曲線脫溶劑管（CDL）溫度：200℃；霧化氣（氮氣）速率：1.5 L/min；干燥氣（氮氣）壓力：170 kPa。

GC-MS分析：色譜柱為Restek?Rtx-5MS石英毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25μm）；程序升溫（0~2 min，70℃；2~27 min，70~320℃；27～29 min，320℃）；進樣口溫度：250℃；載氣（99.999 6%氦氣）線速：36.7 cm/s；進樣量：1μL（分流比20∶1）。電子轟擊離子源（electron impact ionization，EI）電壓：70 eV；離子源溫度：200℃；接口溫度：250℃；溶劑延遲時間：5 min；質量掃描范圍：m/z45～600；采用全掃描模式采集數(shù)據(jù)。

2.3.3 代謝組學數(shù)據(jù)處理及差異代謝物鑒定原始數(shù)據(jù)經(jīng)Profiling Solution軟件處理后導出，經(jīng)扣空白、缺失值填補、面積歸一化等數(shù)據(jù)前處理，導入SIMCA-P 14.1軟件進行主成分分析（princi?pal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘判別分析（orthogonal projection to latent structures-dis?criminant analysis，OPLS-DA）。PCA得分圖用于觀察QC樣本的聚集程度。OPLS-DA模型用于兩組間差異離子篩選，模型中VIP>1的離子，需進一步滿足Mann-Whitney U檢驗P<0.05和|Fold Change|>1.5（FC，給藥組/空白組）。LC-MS差異離子經(jīng)文獻和HMDB數(shù)據(jù)庫（The Human Metabo?lome Database，http：//www.hmdb.ca）比對，并結合實驗室代謝物庫進行差異代謝物鑒定；GC-MS差異離子則通過NIST11.library及標準品比對鑒定。

3 結 果

3.1 胰島素和油酸對促進裸鼠結腸癌細胞皮下移植瘤增殖的影響

結腸癌細胞HCT116皮下移植瘤實驗表明，胰島素和油酸同時給藥可以促進裸鼠皮下移植瘤增殖。最后一次給藥結束后處死裸鼠，剝離瘤體，并對其重量進行測定。結果表明IO組瘤體最重，與INS組及OA組存在顯著性差異（圖1-A）。另外裸鼠處死前各組體重測量結果表明，IO組裸鼠體重最低，且與CON組存在顯著性差異，而INS組及OA組與CON組體重無顯著差異（圖1-B），這一現(xiàn)象與腫瘤體重結果相符，說明腫瘤的異常增殖導致裸鼠身形瘦弱且體重降低。

3.2 非目標代謝組學方法驗證

利用Profiling Solution軟件對GC-MS、LC-MS原始圖譜數(shù)據(jù)進行峰提取（圖2），數(shù)據(jù)經(jīng)預處理后導入SIMCA-P 14.1軟件進行多元統(tǒng)計分析。LCMS和GC-MS裸鼠血清代謝輪廓譜PCA得分圖表示QC樣本聚集良好（圖3-A，圖3-C），且不同樣本中內標穩(wěn)定，在正常范圍內波動（圖3-B，圖3-D），說明儀器穩(wěn)定、方法和結果可重現(xiàn)度高。

3.3 差異代謝物篩選

3.3.1 胰島素和油酸單獨給藥差異代謝物篩選對LC-MS和GC-MS數(shù)據(jù)進行OPLS-DA分析，篩選滿足VIP>1、Mann-Whitney U檢驗P<0.05和|FC|>1.5的離子進行代謝物鑒定。結果顯示，INS組與OA組代謝輪廓和CON組相比，均未發(fā)生顯著改變，未篩選出符合條件的差異代謝物。IO組與OA（圖4-A，圖4-B）或INS組（圖4-C，圖4-D）相比，均呈現(xiàn)出一定程度的差異。其中，IO組與INS組相比，琥珀酸、谷氨酸、3-磷酸甘油及LysoPC（20∶3）含量顯著降低，膽固醇含量顯著升高（表1，圖5-A）；IO組與OA組相比，纈氨酸、尿素、異亮氨酸、膽固醇含量顯著升高，琥珀酸、LysoPC（20∶2）及L-乙酰肉堿含量顯著降低（表1，圖5-B）。以上結果表明，胰島素或油酸單獨給藥與二者聯(lián)合給藥對結腸癌血清代謝輪廓影響不同。

Figure 1 Tumor weight(A)and body weight(B)of nude mice following subcutaneous transplantation of colon carcinoma cell HCT116(xˉ±s,n=6)CON:Control;OA:Oleic acid(2.0 g/kg);INS:Insulin(2.5 U/kg);IO:Insulin(2.5 U/kg)plus oleic acid(2.0 g/kg)

Figure 2 Typical total ion chromatogram(TIC)of nude mice serum samples analyzed by LC-MS(ESI+)(A),LC-MS(ESI-)(B),and GC-MS(C)

Figure 3 3-Dimensional PCA score plots from(A)LC-MSand(C)GC-MSdata;and peak area of internal standard in all samples from(B)LC-MS and(D)GC-MSdata

3.3.2 胰島素和油酸聯(lián)合給藥差異代謝物篩選LC-MS和GC-MS分析結果表明IO組與CON組存在較為顯著的組間差異（圖4-E，圖4-F）。胰島素及油酸聯(lián)合給藥使裸鼠體內阿拉伯糖、鞘氨醇及L-乙酰肉堿含量顯著降低，而尿素及膽固醇含量升高（表1，圖5-C），揭示二者聯(lián)用擾亂了機體原有的代謝平衡狀態(tài)，引起代謝失調紊亂。尿素是體內氨基酸代謝產(chǎn)物，而鞘氨醇、L-乙酰肉堿和膽固醇是脂類代謝相關物質，因此，推測胰島素和油酸聯(lián)用引起糖脂代謝及氨基酸代謝異常，從而對結腸癌發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響。

Figure 4 OPLS-DA scoreplots from LC-MSdata(A,C,E)and OPLS-DA scoreplots based on GC-MSdata（B,D,F）

4 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，同時給予HCT116細胞皮下移植瘤裸鼠胰島素和油酸，血清中膽固醇含量顯著提高。膽固醇是哺乳動物細胞膜組成以及維持膜完整性和流動性的主要脂類成分之一［8］，已有研究發(fā)現(xiàn)，膽固醇異常代謝在一定程度上為腫瘤細胞的增殖和侵襲提供物質和能量基礎［9］。還有研究揭示，膽固醇可以通過調節(jié)miR-33a-PIM3途徑促進結腸癌細胞增殖及細胞周期轉變，并抑制細胞凋亡［10］，在結腸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。在前列腺癌研究中，膽固醇氧化代謝產(chǎn)物27-羥基膽固醇則可以通過刺激雌激素受體β促進前列腺癌細胞的增殖［11］。另外，膽固醇可以通過激活LXRα/β促進卵巢癌化學耐藥的發(fā)生［12］，從而影響化療效果。因此，靶向膽固醇合成代謝通路相關蛋白進行藥物干預有望成為腫瘤治療的新手段［13］。

Figure5 Histogramsof relativecontent in nudemiceof differential metabolitesscreened fromdifferent comparisons

Table1 Differential metabolites in serum of nudemice after administration

此外，本研究發(fā)現(xiàn)另一種參與體內脂肪酸轉運的物質L-乙酰肉堿，在IO組含量顯著下調，提示體內L-乙酰肉堿水平可能與腫瘤惡化程度呈現(xiàn)負相關的趨勢。有研究證實，飲食補充肉堿和乙酰肉堿可以減輕小鼠DSS結腸炎相關結腸癌的嚴重程度［14］。研究人員發(fā)現(xiàn)乙酰肉堿可以增強丁酸鹽的抗結腸癌效果［15］。并且，L-乙酰肉堿還表現(xiàn)出抗腫瘤血管生成的作用［16］。以上研究結果說明胰島素和油酸所引起的結腸癌小鼠代謝紊亂與腫瘤惡化具有一定相關性，提示異常的代謝物水平可以作為臨床腫瘤風險評估的依據(jù)，對疾病的早期診斷具有指導意義。

糖尿病、肥胖等疾病是腫瘤的風險因素［17］，特殊的病理環(huán)境對腫瘤細胞的增殖和浸潤存在較大的影響。已有研究發(fā)現(xiàn)亞油酸預處理可以提高MDA-MB-231細胞對胰島素的應答［18］，說明在高亞油酸環(huán)境中，胰島素促進腫瘤細胞惡性表型的作用顯著提高，證明環(huán)境因素在腫瘤進程中的重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，同時給予荷瘤鼠油酸及胰島素時，其體內代謝輪廓發(fā)生變化，而胰島素和油酸單獨給藥并未造成顯著的代謝改變，說明二者同時存在才會對結腸癌的代謝產(chǎn)生較為重要的影響，油酸及胰島素對結腸癌代謝輪廓的調節(jié)具有條件依賴性。因此，對于臨床結腸癌患者，在其診斷過程中應充分了解患者的疾病史以及飲食偏好等，若其本身同時患有高胰島素血癥或出現(xiàn)體內胰島素過度分泌的情況，應當注意飲食，降低含油酸較高的食物的攝入，盡量選擇低脂飲食，從而避免因機體代謝紊亂而加重腫瘤發(fā)展。

本研究建立了結腸癌細胞HCT116皮下移植瘤模型，對胰島素及油酸給藥后的荷瘤鼠血液樣本進行非目標代謝組學分析，發(fā)現(xiàn)胰島素和油酸聯(lián)合給藥促進了結腸癌發(fā)展，擾動了血清代謝物輪廓，相關結果為進一步研究糖尿患者結腸癌發(fā)病機制奠定了基礎，也可為結腸癌患者的臨床診斷和治療提供參考。