基于p53信號轉導網絡數學模型研究熱療聯合放療在腫瘤治療中的協同效應

孫廷哲

（安慶師范大學生命科學學院，安慶246133）

在對DNA損傷的應答中，維持基因組穩定性對多細胞生物至關重要。細胞內的信號轉導網絡受到不斷變化的生理狀態和環境因素影響，其中溫度是一個重要因素。研究表明，細胞內的部分信號轉導網絡（如晝夜節律）具備補償機制，可對溫度變化不敏感［1］，而NF-κB信號轉導網絡動力學特征則表現出對溫度變化的較高敏感性［2］。最近，Jentsch等［3］通過單細胞熒光實驗發現DNA損傷刺激下，p53信號網絡對也對溫度變化產生應答，其脈沖振幅和頻率隨溫度變化，甚至發生由脈沖到非脈沖的轉變。

轉錄因子p53是重要的網絡節點，可對多種刺激產生響應，并誘導細胞產生一系列應答反應，如細胞周期阻滯、衰老或細胞凋亡［4］。在生理狀態下，細胞內的p53蛋白水平較低，這主要是通過一種E3泛素連接酶MDM2介導的p53降解實現的［5］。mdm2mRNA又受到轉錄因子p53誘導，因此形成一條重要的負反饋環路［6］。而PPM1D/Wip1介導的另一條負反饋環路同樣影響p53的脈沖發生［7］。p53蛋白介導的信號轉導是一個動態過程，p53的動力學特性受到內源性和外源性刺激類型和總量的影響，進而調控細胞對刺激的應答，對細胞命運產生影響［8］。在多數腫瘤細胞中都可以觀察到p53蛋白的失活，這可以通過TP53基因突變、減弱的DNA結合能力或擴增p53的負調控因子MDM2/Wip1［9］。功能性p53水平的不足將會產生藥物抗性并與較低的生存率相關聯［10］。

在靜息狀態下，人體維持相對穩定的核心溫度（約37℃）。然而，受環境溫度影響，體表溫度（尤其在肢端）可降低至約33℃［11］。另外，體溫也受到其他因素影響，如年齡、性別和運動狀態，進而偏離靜息體溫［12］。而在心血管疾病或感染、自身免疫類疾病誘發的發熱狀態下，由于正常血液傳輸和散熱機制受阻，體內核心溫度可能會大幅超過40℃［13］。溫度對機體的影響是多方面的，在分子水平上，溫度可對酶活性產生影響。在細胞水平上，高熱可對代謝、蛋白質合成等過程產生顯著影響［14］。臨床上，熱療輔助常規抗腫瘤療法是一種常用的治療手段。有臨床證據表明，持續（超過1 h）40~42℃熱療結合放療可有效地減小局部腫瘤體積，提高患者生存率［15］。過熱（hyperther?mia）可對p53信號轉導網絡動力學產生顯著影響［3］，但溫度變化如何影響p53信號網絡尚缺乏理論研究。

本文通過構建微分方程模型，結合隨機模擬方法系統模擬了溫度對p53動力學的影響。模型也模擬了細胞過熱處理后，當溫度降至正常體溫時p53脈沖的重現。同時，本研究也揭示了溫度與輻射劑量的協同效應。此協同性可能為熱療輔助放療的有效性提供一種新的解釋。

1 材料

1.1 軟件

數值模擬使用美國MathWorks公司MATLAB軟件實現（版本R2018b）。

2 方法

2.1 構建p53網絡模型

基于之前的10變量p53網絡模型［16］，描述p53通路對DNA損傷刺激的應答，形成時滯微分方程（表1）。電離輻射（ionizing radiation，IR）可誘導DNA雙鏈斷裂損傷（DNA double strand break，DSB）并磷酸化激活共濟失調毛細血管擴張突變（ataxia-telangiectasia mutated，ATM）［17］。將總ATM水平設為常量［18］。活化的ATM（變量ATM*）可以磷酸化p53和MDM2，磷酸化的p53（變量P53p）變得更加穩定而磷酸化的MDM2（變量MDM2p）則加速 降 解［19］。模 型 中 整 合 了p53-MDM2［6］和p53-Wip1-ATM［7］兩條負反饋環路，故p53蛋白（變量P53），MDM2蛋白（變量MDM2）和Wip1蛋白（變量WIP1）蛋白計3個變量引入模型。考慮轉錄過程，p53mRNA分子（變量p53），MDM2mRNA分子（變量mdm2）和Wip1mRNA分子（變量wip1）也予以考慮并整合入模型。過熱狀態下，細胞內Hsp70的水平顯著上升，作為分子伴侶抑制p53和MDM2的結合，從而提高p53的穩定性［20］。通過運用Arrhenius［21］方程項，表示溫度對MDM2降解p53的影響（表1和表2）。基于最近的研究，磷酸化的MDM2與p53mRNA的結合（變量p53MDM2p）以及翻譯增強效應也整合進入了模型（表1）［22］。出于簡化模型目的，未考慮所有分子的亞細胞定位。降解、磷酸化和去磷酸化反應使用質量作用（mass action）定律進行描述，較之Michaelis-Menten方程可顯著減少未知參數個數。另外，Michaelis-Menten方程較之質量作用定律具有更強非線性，更易產生復雜動力學行為［16］。參數取值見表2。

Table1 Delayeddifferentialequationsforp53model

2.2 隨機模擬

由于模型中最大分子個數超過105，因此使用加速τ-leap算法并引入時滯項τ［23］。在隨機模擬過程中，所有τi（i=1，2，3，4）均圍繞參考值產生±3%擾動。

2.3 協同性

溫度和輻射劑量的協同通過Loewe和Bliss協同 指 數（combinationindexes，CI）進 行 度 量［24］。Loewe協同指數（CILoewe）定義為：

其中d1（溫度）和d2（DNA雙鏈斷裂DSB）指等效線圖（isobologram）中達到40%最大效應時所對應的劑量。GC(1)x和GC(2)x分別代表單獨變化溫度或DSB的取值并使效應值增加40%時，所需的溫度或DSB量。在等效線圖中，若圖像呈下凸形態，表明系統存在協同性。

Bliss協同指數（CIBliss）定義為：

其中R1（x），R2（y）和R12（x，y）分別指溫度為x、DNA雙鏈斷裂數量為y，溫度-DNA雙鏈斷裂組合劑量為［x，y］時，p53效應的相對變化。p53的效應為總p53蛋白水平在時間上的積分和總p53蛋白的最大值。

3 結 果

3.1 溫度對p53脈沖的影響

此模型主要包含兩條負反饋環路（p53-MDM2和p53-Wip1-ATM）。模型中，溫度（T）影響MDM2和p53的結合，即MDM2對p53的降解作用（表達式見表1）。用10 Gy輻射刺激系統，模擬Jentsch等［3］的實驗條件，方程（9）中初始DSB取值設定為300，即依據文獻報道1 Gy輻射劑量平均產生30個DNA雙鏈斷裂損傷［30］。當溫度設置為33℃時，總p53蛋白（磷酸化和未修飾p53總和）呈現持續的無衰減脈沖，脈沖的周期約為5.9 h（圖1-A）。當增加溫度至35℃和37℃時，持續的脈沖仍能被觀測到。注意到隨著溫度的升高，p53首個脈沖的振幅逐漸增加，同時持續脈沖的周期進一步縮短（圖1-C），模擬的脈沖周期與Jentsch等［3］的實驗結果一致。值得注意的是，當繼續增加溫度至39℃，首個脈沖的振幅進一步增加。系統雖在24 h內能進行持續脈沖，但脈沖的振幅呈現逐漸衰減趨勢（圖1-C）。注意到p53首個脈沖的出現時間隨著溫度的增加而逐漸加速，表現為脈沖峰值的提前（圖1-B）。當溫度增加到41℃時，p53的持續脈沖完全消失，p53蛋白水平在首個脈沖回落以后呈持續增長的趨勢（圖1-C）。綜上所述，溫度對p53的動力學特征產生影響，過熱狀態下p53的脈沖將被破壞。在Jentsch等［3的實驗中，當溫度達到41℃時，10 h后p53的水平具有明顯的下降趨勢。另外，信號轉導網絡中的生化反應發生本身是一個隨機過程［28］，需要進行隨機模擬。因此，后續將對模型進行一定的修正，從而更好擬合。

Table2 Descriptions and values for variables or parameters in p53 model

Figure1 Effect of temperatureon p53 pulses

3.2 隨機模擬重現p53的動力學特征

如上所述，在41℃過熱處理下，確定性常微分方程中總p53的水平在10 h后未有下降趨勢。為修正此不足，在隨機模擬中，引入DNA損傷修復作用。根據M?nke等［31］報道，將模型中DSB修復設置為（Ns?Nb）e?rt+Nb，其中Ns為輻射誘導DSB數量（即30 DSB/Gy），Nb為細胞中本底DSB數量。模型中設定為Nb=3，r=0.004。將DNA損傷修復過程整合入模型后，給予10 Gy輻射刺激（計300 DSB），在41℃下，發現在此25 h觀察窗口內的晚期，p53水平即總p53分子數逐漸下降（圖2-A）。由于輻射誘導的DSB被不斷修復，因此DSB對ATM活化的作用減弱，進而導致41℃下后期p53水平降低（圖2-A）。值得注意的是，即使未予外源性輻射刺激（0 Gy），較之33~39℃，在41℃時，細胞中的p53水平也呈現較為明顯的上升（圖2-A）。此模擬結果與Jentsch等［3］的實驗結果是吻合的。另外，通過基音試別（Pitch detection）計算p53脈沖特征基音所在位置。結果顯示，在33℃時，p53首個脈沖出現較37℃晚，而39℃時，p53首個脈沖基音則較之37℃時更早出現（圖2-B）。雖然從中位數水平可比較基音出現的時間次序，但總體而言，各個溫度下p53第一個脈沖基音分布具有較大的重疊。另外，p53第2和第3個脈沖的基音分布特征與第一個脈沖具有相似隨溫度變化的趨勢（圖2-B）。脈沖的振幅隨溫度的變化趨勢如圖2-C所示。對p53的首個脈沖而言，溫度從33℃增加到37℃，振幅隨溫度升高而增大。而39℃時，首個脈沖的振幅和37℃比未見明顯增加（圖2-C）。而對于第2和第3個p53脈沖，溫度對脈沖幅度的影響明顯減弱（圖2-C）。計算500組隨機模擬中不同時間點的相關系數以進一步闡明p53脈沖隨溫度的變化。結果顯示，時間點相關系數的特征隨溫度發生變化。在33~37℃下，可以觀察到較為明顯的周期性特征，而在41℃時，周期性特征則基本消失（圖2-D）。值得注意的是，在41℃時，p53蛋白水平的強相關性較之在33~39℃時顯著延長，表明細胞在過熱條件下，早期給予強刺激能夠保證細胞在較晚時期仍具有較強應答。這些結果表明，隨機模擬結合DNA損傷修復可以更好的模擬溫度對p53動力學特征的影響。

Figure 2 Characteristics of p53 pulses are varied with changingtemperature

3.3 溫度和輻射刺激產生協同性

溫度可以影響p53的動力學形態，進一步，通過等效線圖繪制和計算Bliss協同指數探索溫度影響p53信號轉導的潛在意義。首先運用累積p53水平作為系統反應指標，計算Bliss協同指數。結果顯示，溫度和DSB刺激產生了協同效應（CIBliss<1，圖3-A）。協同性的變化受到溫度和DSB數量的影響，其中溫度的影響更為顯著，表現為Bliss協同指數沿溫度升高方向快速下降（圖3-A）。若以最大p53蛋白水平作為系統反應指標，也得到了類似的變化趨勢（圖3-B）。進一步，利用Loewe等效線圖研究溫度和輻射刺激的協同作用。Loewe等效線圖顯示，溫度和DSB數量同樣產生了協同效應（圖3-C）。以最大p53蛋白水平作為反應指標的等效線圖同樣表明溫度和輻射刺激兩者間的協同效應（圖3-D）。

Figure3 Synergy between temperatureand irradiation-induced DNA damage

從p53的累積值響應平面上，可以觀察到當溫度較低時，累積p53水平沿DSB數量的增加方向上升緩慢；而當溫度增高時，輻射刺激的增加可以更為顯著提升累積p53水平（圖4-A）。p53最大值的響應平面也具有類似的趨勢（圖4-B）。以上分析結果表明，溫度可以增強p53對輻射刺激的應答，同時過熱狀態可有效引發溫度與輻射刺激的協同效應。

3.4 模擬p53對溫度應答的可逆性

為進一步模擬實驗中發現的p53對溫度應答的可逆性［3］，首先設定模型初始溫度為41℃。在6 h后，重新設定模型中系統溫度為37℃。隨機模擬結果顯示，總p53蛋白水平首先迅速上升并達到峰值（圖5-A）。如上所述，若系統溫度持續設為41℃，p53將不會出現后續脈沖（圖2）。但6 h后降低系統溫度至生理溫度37℃，模擬顯示經歷短暫時滯后，p53脈沖重新出現。后續p53脈沖持續時間可能較長，也可能迅速衰減（圖5-A）。就群體水平而言，總p53蛋白水平首先經歷急速上升過程，達到峰值后下降。在溫度降至37℃后，p53的脈沖重現，但其脈沖峰值隨時間不斷衰減，直至p53脈沖消失（圖5-B）。500組隨機模擬結果表明，降低溫度至37℃后細胞會重啟p53脈沖（圖5-C）。以上模擬結果顯示，p53脈沖對溫度變化具有可逆性，與Jentsch等［3］的實驗結果一致。

Figure4 Responsesurfaceof p53 featurestotemperatureand DSBnumbers

Figure 5 Dynamical p53 response to hyperthermiais reversible

4 討論

p53信號轉導網絡介導的信息傳遞過程是機體對環境刺激應答的重要環節。為了探討溫度對p53動力學性質的影響，本研究構建了p53信號通路常微分方程模型。對微分方程的數值求解表明電離輻射刺激下，p53的動力學形態隨溫度增加發生轉變，由脈沖轉變為持續累積。同時在33℃~39℃下，p53脈沖的振幅和周期分布也和溫度變化具有強相關性。p53的脈沖也具有一定的異質性（heterogeneity）。模擬結果揭示溫度對p53動力學形態調控的生理學意義，即合適的溫度和輻射刺激組合具有很強的協同效應，能有效的增強系統中p53的應答反應。p53的脈沖周期［32］和持續累積的幅度［33］是對刺激信號的重要編碼，直接對細胞命運產生決定性影響。因此，溫度對p53動力學形態的影響將直接關系到細胞的命運選擇。p53對溫度變化的敏感性特征表明p53信號網絡并不具有溫度代償機制，這與最近關于NF-κB的發現相類似［2］。在NF-κB的網絡中，環境溫度信息被編碼成RelA振蕩的頻率，通過RelA的核轉位影響下游基因表達，從而形成對溫度的應答［2］。因此，溫度依賴的p53動力學性質變化可能會誘導差異化基因表達，進而影響下游細胞反應。溫度影響的p53下游靶基因表達可能只限于早期［3］。模型模擬顯示p53首個脈沖表現出對溫度的強敏感性，而后續脈沖對溫度的響應會逐漸減弱。此結論為Jentsch等［3］的實驗發現提供一個可能的解釋。進一步的實驗和模型研究可能會更好的揭示溫度對基因表達時程的影響。

在過熱條件下，p53脈沖消失，在一定時間內p53呈持續累積的動力學行為。持續的p53累積可能會誘導高水平的關鍵靶基因表達（例如CD?KN1A/p21）從而導致細胞周期阻滯或衰老［34］。因此，p53動力學反應的可逆性至關重要。在過熱條件下，持續累積的p53可以誘發暫時的細胞周期阻滯以修復損傷DNA，維持基因組穩定性。而當細胞恢復至生理溫度后，p53脈沖將重現并保證細胞重新進入細胞周期，維持細胞更新及穩態。利用MDM2小分子抑制劑Nutlin-3改變p53動力學形態，Purvis等［35］發現脈沖形態或持續高水平表達的p53蛋白對細胞命運具有顯著影響，p53脈沖促進細胞生存而持續高水平p53表達則誘導永久性細胞周期阻滯。較低溫度可誘發p53脈沖而較高溫度則會促使p53蛋白維持高表達狀態，這與不同劑量Nutlin-3對p53動力學的影響相似［3］。所以，溫度可模擬抑癌小分子Nutlin-3改變p53動力學形態進而對細胞命運產生影響。

熱療輔助放療已被廣泛用于臨床腫瘤治療，且此組合療法具有不良反應小的優點［36］。但在分子水平上，熱療（過熱狀態）是如何影響腫瘤治療的效果仍舊是一個未解決的問題。通過計算Bliss協同指數和繪制Loewe等效線圖發現，溫度和輻射刺激產生了協同效應。在適度過熱條件下，溫度和輻射刺激的協同效應顯著增強。過熱狀態通過抑制MDM2對p53的降解，削弱p53-MDM2負反饋對p53的負向調控作用，從而誘導p53水平的升高。另外，溫度對協同效應的影響可能更高效，表現為Bliss協同指數圖中CIBliss沿著溫度升高方向急劇降低。所以，熱療輔助放療中設置適當的溫度將更有利于產生高協同效應。但同時應注意到，在一定的范圍內，溫度和輻射刺激的協同效應較弱（如低于生理溫度區域）。此分析表明運用合適的過熱溫度輔助放療才可能引起強協同效應，進而提高腫瘤治療的效果。但本研究所揭示的協同效應依賴于細胞中存在野生型或功能型p53蛋白。若TP53發生突變以致失活，或負調控蛋白MDM2在腫瘤中過表達［37］，那么溫度的協同效應可能不再適用。在TP53突變細胞中的進一步實驗和理論研究將有助于解決這一問題。

此模型仍有不足，如隨機模擬過程中主要考慮了內源性噪聲（intrinsic noise），未對模型初值和參數進行隨機化，而初值和參數的隨機化將更多的引入外源性噪聲（extrinsic noise）［38］。外源性噪聲的引入可能會更好的擬合實驗數據。本模型僅考慮溫度對p53蛋白降解的影響，其他機制的發現將有助于提高模型的精度。總之，此模型模擬了溫度對p53的動力學形態影響，揭示了溫度和輻射刺激的協同效應，為熱療輔助放療提供了一個有益的理論參考。

致謝：穆丹老師幫助本論文順利完成。