蛋白精氨酸甲基轉移酶5抑制劑研究進展

詹康寧，全 旭，黃張建，趙立文*

（1中國藥科大學新藥研究中心，南京210009；2南京圣和藥業股份有限公司，南京210038）

蛋白質精氨酸甲基轉移酶（protein arginine methyltransferase，PRMT）催化的精氨酸胍基甲基化，是一種常見的真核生物細胞翻譯后修飾，影響細胞信號傳導、基因轉錄、mRNA翻譯、DNA重組和修復等多種生物學過程［1-4］。作為PRMT家族的成員，PRMT5介導的甲基化在維持正常細胞內環境平衡中發揮重要作用。然而，越來越多的研究表明，PRMT5的異常表達與多種腫瘤發生相關，目前已被認定為抗腫瘤藥物研發的重要靶點［5］。本文介紹了PRMT5的結構、生化功能及其與腫瘤的相關性，對目前在研的PRMT5抑制劑進行綜述，并討論了PRMT5抑制劑的未來發展方向。

1 PRMT家族

PRMTs甲基化特定精氨酸胍基氮原子，由S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）提供甲基，同時釋放出一個分子的S-腺苷-L-同型半胱氨酸（S-adenosyl-L-homocysteine，SAH）。根據修飾形式，將PRMTs分成3類（圖1）：第1類（PRMT1、2、3、4、6、8）催化形成ω-NG-單甲基精氨酸（monomethyl?arginines，MMA）和ω-NG，NG-不對稱二甲基精氨酸（asymmetric dimethylarginines，aDMA）；第2類（PRMT5、9）催化形成ω-NG-MMA和ω-NG，N'G對稱二甲基精氨酸（symmetric dimethylarginines，sD?MA）；第3類（PRMT7）只催化ω-NG-MMA的形成［6］。PRMT1和PRMT5分別是主要的aDMA和sDMA形成酶，兩者相較于其他PRMTs底物更多，目前研究表明在多種腫瘤中PRMT5表達水平升高［5］。

圖1 3種PRMTs催化精氨酸甲基化反應

2 PRMT5的結構特征

PRMT5是細胞中主要的sDMA形成酶，N端為TIM桶狀結構蛋白（TIMbarrel），C端是甲基轉移結構域（圖2）［7-8］。TIMbarrel與甲基轉移酶復合體蛋白50（methylosome protein 50，MEP50）結合形成活性更高的復合體［9］。甲基轉移結構域由底物結合位點和SAM結合位點組成，這兩個結合位點通過一條狹窄的疏水通道（由Leu312、Phe327和Trp579形成）相連，使底物和SAM接近。活性部位有兩個高度保守的谷氨酸殘基（E435和E444）形成雙E環。每個谷氨酸殘基與底物精氨酸的胍基形成一對鹽橋，從而允許甲基從SAM通過SN2過渡態轉移到精氨酸殘基上［10］。

圖2 PRMT5:MEP50復合體的總體結構(PDB：4GQB)(A)和放大的H4R3底物肽結合槽(B)[11]

在一項對線蟲PRMT5的突變研究中，將底物口袋中的保守殘基之一Phe379變為蛋氨酸，可以實現H4R3同時進行sDMA和aDMA［7］。同樣的，當人PRMT5中相應位置的Phe327突變也相應導致aDMA活性增強［7］。Phe327是PRMT5特有的殘基，與sDMA功能密切相關，這可能是設計PRMT5特異性抑制劑時要考慮的一個重要因素。

3 PRMT5的生化功能

PRMT5廣泛存在于細胞核和胞漿中，通過調控組蛋白及多種非組蛋白的甲基化修飾影響各種細胞過程。

PRMT5通過許多核質底物的甲基化起作用，包括組蛋白H2A、H3和H4［12］，Sm蛋白［13］，RAF蛋白［14］等等。組蛋白精氨酸sDMA被認為是一種阻遏標記，調節基因轉錄［12］。也有證據表明PRMT5通過Sm蛋白甲基化參與調節哺乳動物正確的mRNA結構性剪接［15］。PRMT5通過RAF蛋白甲基化調控RAS-RAF-MEK-ERK信號通路［14］。

部分非組蛋白也被鑒定為PRMT5的底物，在細胞功能調控中發揮重要作用［16-18］。例如，在DNA損傷時，PRMT5甲基化腫瘤抑制因子p53的3個精氨酸（Arg333，Arg335，Arg337），改變了p53與DNA的結合活性，進而觸發p53控制的基因表達程序改變［17］。此外，PRMT5可甲基化轉錄因子E2F-1和NF-κB的P65，從而誘導目標基因的表達［19-20］。并且PRMT5也可與其他細胞蛋白結合，如高爾基體蛋白GM130、核糖體蛋白S10，分為維持高爾基體結構和核糖體正確組裝［21-22］。

4 PRMT5與腫瘤的關系

最近幾年，作為一個抗腫瘤藥物靶點，PRMT5越來越引起科學界的關注。它在多種腫瘤中過表達，包括膠質母細胞瘤、肺癌、前列腺癌等，并在不同腫瘤中發生機制不同［5］。

例如，在臨床上越來越多人膠質母細胞瘤病例的發生與PRMT5過表達相關［23］。研究發現，定位于腫瘤細胞胞漿的長非編碼RNA，LINC00515與SNHG16，分別通過miR-16與miR-4518調節PRMT5高表達，招募并限制腫瘤抑制基因ST7與PTEN的表達，導致腫瘤發生［24-25］。相同的，PRMT5在人肺癌組織中顯示高表達，在組織培養中，下調PRMT5的表達和使用PRMT5選擇性抑制劑可明顯抑制肺癌A549和H1299細胞的增殖。研究顯示PRMT5是蛋白激酶B的上游調節因子，直接與蛋白激酶B共定位并相互作用，從而誘導肺癌細胞增殖［26］。在前列腺癌中，PRMT5通過表觀基因激活前列腺癌細胞中雄激素受體（androgen receptor，AR）的轉錄來促進前列腺癌細胞的生長［27］。免疫共沉淀結果顯示PRMT5與負責AR轉錄的主要轉錄因子Sp1、ATP依賴的染色質重塑劑BRG相互作用，誘導AR基因啟動子區域的H4R3對稱甲基化，激活并促進細胞生長。因此敲減PRMT5或用特定的PRMT5抑制劑會減少AR的表達，從而抑制AR陽性（而非陰性）的前列腺癌細胞生長［18］。

此外，由于代謝酶5-甲硫腺苷磷酸化酶（5'-methylthioadenonine phosphorylase，MTAP）基因與人類染色體9p21上的抑癌基因CDKN2A非常接近，因此在CDKN2A基因缺失的腫瘤中經常伴隨MTAP缺失，是腫瘤中突變頻率最高的基因之一。MTAP缺失使其底物甲硫腺苷（methylthio?adenosine，MTA）積累，MTA能選擇性抑制PRMT5甲基轉移酶的活性，并使其對進一步的PRMT5抑制更為敏感［28］。這表明PRMT5抑制劑可以成為MTAP缺失或低表達腫瘤患者的一種高度選擇性的治療方法。

5 新型PRMT5抑制劑

近年來，PRMT5作為腫瘤治療的潛在靶點受到特別關注［11，16，29-34］。目前已有大量PRMT5小分子抑制劑報道，根據化合物是否占據SAM結合位點，可將其分為兩類，SAM非競爭性抑制劑和SAM競爭性抑制劑，其中SAM非競爭抑制劑占據底物結合位點與底物競爭，而SAM競爭抑制劑則是占據SAM的結合位點。

5.1 SAM非競爭性抑制劑

5.1.1 EPZ015666 EPZ015666是第一個報道的具有細胞增殖抑制活性且可口服的PRMT5抑制劑，其IC50為22 nmol/L［35］。在一組5種髓細胞白血病（myeloid cell leukemia，MCL）細 胞 系（Z-138，Maver-1，Mino，Granta-519和Jeko-1）中，EPZ015666以濃度依賴的方式降低了SmD3甲基化水平和細胞增殖效應，在PRMT5基因敲除細胞中也觀察到同樣的SmD3降低。利用細胞熱位移分析進一步確認EPZ015666與細胞內的PRMT5特異性結合。該化合物在小鼠體內表現出良好的藥代動力學特性，靜脈給藥2 mg/kg后，AUC0-t為1 110 h·ng/mL，t1/2為1.38 h，分布體積為1.67 L/kg，血漿清除率為30 mL/（kg·min）。小鼠經口給予10 mg/kg，cmax為3 500 ng/mL，AUC0-t為3 847 h·ng/mL，t1/2為1.62 h，生物利用度為69%［36］。在一項Z-138皮下異種移植腫瘤小鼠模型的21 d體內藥效學研究試驗中，經口給予EPZ015666（200 mg/kg，po，bid），腫瘤生長抑制率接近95%［36］。

PRMT5：MEP50-SAM-EPZ015666共晶結構顯示（圖3），在SAM存在下，EPZ015666結合在肽結合部位，提示它是與肽底物（Ki=5±0.3 nmol/L）而非輔因子SAM發生競爭。為了找到EPZ015666對PRMT5高選擇性的原因，進一步對晶體結構分析，發現EPZ015666與許多殘基相互作用，在sDMA過程中起重要作用。特別是四氫異喹啉（THIQ）結構在這個過程中發揮重要作用：（1）THIQ的苯環與SAM之間存在陽離子-π相互作用；（2）THIQ環與PRMT5特有的殘基Phe327形成潛在的π-π堆積作用，其他PRMTs在該位置的殘基是Met［7］；（3）THIQ位于由Leu319、Tyr324、Phe327和Trp579形成的疏水小口袋中，不利于極性官能團或體積大的基團；（4）THIQ的叔胺氮原子在水介導下與E435相互作用，影響整體催化過程。此外，EPZ015666的手性羥基和E444的側鏈之間可能存在氫鍵相互作用，因此EPZ015666與之對應的立體異構體活性會有較大差異。EPZ015666的末端嘧啶基團也和Phe327、Phe580有π-π堆積作用。上述相互作用可能是EPZ015666對PRMT5的高親和力和高選擇性的原因［36］。

圖3 EPZ015666與PRMT5:MEP50和SAM的共晶結構(PDB：4X61)[35]

5.1.2 GSK3326595 化合物GSK3326595保持了THIQ結構，PRMT5酶抑制活性IC50為6.2 nmol/L，該化合物分別通過調節人結腸癌細胞株SW480中p53與人套細胞淋巴瘤細胞株Z-138中p21的活性抑制SW480與Z-138增殖，誘導細胞周期阻滯。在Z-138皮下腫瘤異種移植小鼠模型中，GSK3326595有效抑制腫瘤體積（0.2～100 mg/kg，po，bid或50～200 mg/kg，po，qd）。同時該化合物呈現良好的藥代動力學特性，靜脈給藥1 mg/kg后，AUC0-t為415 h·ng/mL，t1/2為1.42 h，分布體積為1.42 L/kg，血漿清除率為39 mL/（kg·min）。小鼠經口給予1 mg/kg，cmax為1 050 ng/mL，AUC0-t為3 450 h·ng/mL，t1/2為0.25 h，生物利用度為80.7%［37］。它具有良好的腦通透性和抗腫瘤效果，目前開展的兩項Ⅰ期臨床試驗，用于評價其在治療實體瘤、非霍奇金淋巴瘤（NCT02783300）和骨髓增生異常綜合征、急性髓性白血病（NCT03614728）的安全性和臨床療效。

5.1.3 其他PRMT5非競爭性抑制劑 為了開發更有效的PRMT5抑制劑，研究人員將GSK3326595的2位側鏈移至3位，得到了一系列活性化合物，如化合物1對PRMT5具有很高的抑制活性（IC50=26 nmol/L）［38］。在此基礎上，默沙東公司利用環合策略獲得了3，4-二氫-2，6-萘啶-1-酮類抑制劑，結果提示了手性羥基對PRMT5的氫鍵作用的重要性。經過分離得到了不同構型的小分子化合物2和化合物3，其中一個化合物的活性（IC50=10.84 nmol/L）明顯強于另一個化合物（IC50=481.5 nmol/L）。有趣的是，在化合物2和化合物3的萘啶酮4位引入兩個甲基得到了活性更高的化合物4（IC50=1.53 nmol/L）和化合物5（IC50=56.89 nmol/L），提示在這個位置可能還存在除了能夠與Phe327和Phe580形成π-π堆積之外的其他的作用力，因此值得開展進一步的結構優化探索［39］。此外，阿古諾公司將THIQ替換成三環結構，得到一系列化合物，其中代表的化合物6與GSK3326595極為類似，PRMT5酶抑制活性IC50為10 nmol/L［40］。

此外，研究人員在EPZ015666的基礎上發現了一種新型萘環抑制劑，經過優化后得到了DCC01（IC50=2.8μmol/L），它能夠呈劑量依賴地抑制一些腫瘤細胞（Z-138、Maver-1和Jeko-1）增殖［41］。分子對接結果顯示，DC-C01的2位上苯環類似于EPZ015666的末端嘧啶，可能與Phe327和Phe580形成π-π堆積，而1位側鏈上的苯環則可能與SAM形成陽離子-π相互作用，并且有可能與Phe327產生π-π堆積［41］。

5.2 SAM競爭性抑制劑

5.2.1 A9145C PRMTs含有高度保守的輔因子SAM甲基轉移結合域，而SAH和天然產物西奈芬凈則是SAM的結構類似物，兩者均顯示出良好的PRMT5抑制活性，但對其他PRMTs缺乏選擇性。A9145C是早期基于西奈芬凈結構研發出的SAM競爭抑制劑，在與PRMT5：MEP50和H4組蛋白肽段的晶體結構中顯示，A9145C可以和SAM結合域中的幾個殘基（如，Asp419、Met420、Glu392和Try324）互相作用，但是它產生相互作用的結構與SAM對應的結構一致，包括腺苷部分的主體與兩個氫鍵、尾部的羧基，僅有C5氨基部分可能與組蛋白H4產生額外的相互作用，因此它雖然能很好地結合在SAM結合域中，但仍然缺乏對PRMT5的選擇性［9］。

5.2.2 LLY-283 在后續的研究中，MTA被證明是一種有效的、選擇性的PRMT5抑制劑［28］。這一發現提示模擬SAM結構的核苷類似物有望對PRMT5產生較好的選擇性抑制活性。為此，2018年，發現了一種有效的選擇性PRMT5抑制劑LLY-283，具有較強的PRMT5酶抑制活性，IC50為20 nmol/L［42］。LLY-283是SAM的類似物，其中苯基取代了SAM中的蛋氨酸部分，且與核糖的構象十分類似。除了與相同殘基的相互作用外，LLY-283的苯基與PRMT5特有的殘基Phe327形成π-π堆積［42］。此外研究發現，將吡咯嘧啶換成其他芳雜環基團時，酶抑制活性下降［43］。在體外細胞增殖抑制實驗中，LLY-283對在許多血液瘤和實體腫瘤細胞系（HCC1937、NUGC3、MV4-11、NCI-HI1930、A375等20余種）中都觀察到了強大的抗增殖作用。在人黑色素瘤A375腫瘤異種移植小鼠模型中，給藥28 d，LLY-283（20 mg/kg，qd）顯著抑制腫瘤生長［42］。該化合物具有良好的ADME性能，小鼠經口給予10 mg/kg，cmax為3 646 ng/mL，AUC0-t為7 943 h·ng/mL，t1/2為3.41 h，生 物 利 用 度 為50%［42］。

5.2.3 JNJ6461978 JNJ64619178是第一個進入臨床試驗的基于SAM結構的模擬核苷類似物（NCT03573310），采用環戊烷替代了SAM中的四氫呋喃環。它對PRMT5酶的抑制活性IC50為6.3 nmol/L，并對 一 組 肺 癌 細 胞（A549、NCI-H441、H1048、HCC78）表現良好的增殖抑制活性［44-45］。分子對接顯示，喹啉環與Phe327形成π-π堆積，并且可能占據了組蛋白底物精氨酸的位置，而喹啉上的氨基則與雙E環中的E444相互作用。這種相互作用方式表明，JNJ64619178對SAM和底物都有潛在的競爭性作用［34］。

5.2.4 其他SAM競爭性抑制劑 LLY-283和JNJ64619178的發現激發了更多研究者對SAM競爭性抑制劑的興趣。鑒于PRMT5的活性位點附近有一個特有的半胱氨酸C449，人們推測其可作為潛在的共價修飾位點［34］。最近，Prelude公司報道一個醛類化合物7，它和PRMT5的相互作用與LLY-283類似，所不同的是，該化合物的醛基能額外地與C449巰基產生親核加成反應，在生理pH條件下，形成的中間體會自動消除一分子水，從而形成乙烯基硫醚（圖4）。該化合物顯示良好的PRMT5選擇性，IC50為19.5 nmol/L［46］。研發共價抑制劑不僅有利于提高對化合物的選擇性，或許還有助于將來解決PRMT5抑制劑潛在的耐藥性。

圖4 乙烯基硫醚的形成過程

6 總結與展望

近年來，PRMT5抑制劑已成為抗腫瘤藥物研發的熱點，然而目前已報道的大多數抑制劑仍局限于類似的骨架結構。在不同腫瘤發生過程中，PRMT5導致腫瘤發生的機制各有不同且部分尚未明確，為了更好地了解PRMT5的治療潛力，還需要挖掘更多關于PRMT5功能的生物學信息。

對于SAM非競爭性抑制劑，諾華公司和Agios公司對該類抑制劑底物結合的模式進行了實驗，發現EPZ015666能夠有效地抑制許多細胞株的體外生長，但缺乏腫瘤細胞株選擇性，并且它對腫瘤細胞的抑制能力與細胞中MTAP的狀態無關，這就有可能在臨床試驗中轉化為潛在的毒性［28，47］。在MTAP缺乏的細胞中，MTA累積并部分抑制細胞中的PRMT5，使腫瘤細胞對PRMT5抑制劑敏感。這可能提供一個新的結合思路，設計一種小分子協同MTA與PRMT5結合，并特異性結合MTA：PRMT5復合物，從而抑制腫瘤細胞生長。

總之，隨著對PRMT5生化功能的進一步研究，各類化合物與PRMT5結合的共晶結構的不斷被報道，安全的PRMT5抑制劑逐漸被人們所發現并最終應用于臨床，使腫瘤患者獲益。