三七總皂苷玉米脂蛋白納米粒對大鼠腦缺血再灌注損傷的藥效學研究

梁意萍，付 文，張振海，呂慧俠**

（1中國藥科大學藥學院藥劑系，南京211198；2南京中醫藥大學附屬中西醫結合醫院江蘇省中醫藥研究院，南京210028）

三七總皂苷（Panax notginsengsaponins，PNS）來源于五加科植物三七，具有改善腦缺血和缺血再灌注引起的損傷、促進神經功能恢復、降低心肌耗氧量、改善心肌供血等功能［1-3］，被廣泛用于治療心腦血管疾病。PNS的常用劑型有注射劑、片劑、膠囊劑以及顆粒劑等，如主成分為PNS的血塞通注射劑是一種臨床常用的藥物。但是中藥注射劑的不良反應高發，而且心腦血管疾病的防治通常需要長期用藥，因此，開發PNS的口服劑型改善患者的順應性十分必要。

PNS中的主要成分三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1均屬于具有一定表面活性的皂苷類成分，由皂苷元和糖基構成，具有易溶于水，膜滲透性差的特點［4-6］。PNS在胃腸道中不穩定，易被胃酸破壞或被腸道菌群分泌的糖苷酶水解［7-9］，從而導致口服生物利用度較低。為提高PNS口服制劑的生物利用度，有報道將PNS制成油包水（W/O）型納米乳或PNS復合納米囊泡等納米制劑進行口服給藥，經驗證這種納米結構能有效改善游離PNS口服吸收差的缺點，提高藥物的治療效果［10-12］。

玉米醇溶蛋白（zein）是一種生物相容性良好的植物蛋白，含有超過50%的疏水性氨基酸，形成了同時具有親水區域和疏水區域的兩親性蛋白，這種兩親性特征是玉米醇溶蛋白能夠自組裝的主要原因之一［13］。R1、Rg1和Rb1借助其親脂性苷元和親水性糖基，在玉米醇溶蛋白自組裝的過程中與其親水或疏水區域互相纏繞結合，實現對藥物高效率的包封與裝載，如Hong等［14］將卵磷脂包裹在玉米醇溶蛋白表面制備了核殼型結構的納米粒來包載藥物，相比僅有磷脂的納米粒，核殼型納米粒的載藥量提高了2.3倍。由于玉米醇溶蛋白在中性溶液中不穩定易聚集，因此將玉米醇溶蛋白與透明質酸等多糖或磷脂共用來提高玉米醇溶蛋白納米粒的穩定性［15］。另外，Xie等［16］制備的脂化蛋白納米粒與人工胃液共孵育后，藥物殘留量從游離組的（29.49±3.28）%增加到了納米粒組的（43.00±3.77）%，說明脂化蛋白納米粒的結構可在一定程度上保護玉米醇溶蛋白和藥物不被酸性環境和酶破壞。

實驗借鑒納米制劑能夠提高藥物口服吸收，玉米醇溶蛋白能有效提高載藥量的特點，設計并制備了PNS、玉米醇溶蛋白、卵磷脂和β-谷甾醇共組裝的三七總皂苷玉米脂蛋白納米粒（PNS-lipidzein nanoparticles，PLZ-NPs）。其中卵磷脂作為一種能增強藥物膜滲透性的兩性離子表面活性劑，常與膽固醇共用制備脂質體［17-18］，它能提高納米粒穩定性以及增強藥物與細胞膜的親和力；β-谷甾醇是一種結構與膽固醇相似的植物甾醇，具有良好的抗氧化活性，取代膽固醇作為脂質體膜材，可避免膽固醇導致心腦血管疾病的負面效應［19］。本實驗期望所制備的PLZ-NPs納米粒中的玉米醇溶蛋白能實現自組裝負載PNS，同時納米粒外層的磷脂與β-谷甾醇可以提高玉米醇溶蛋白納米粒的穩定性，增強納米粒與腸道上皮細胞的親和性，并降低胃腸道中酶對藥物的降解，最終能提高PNS的口服生物利用度，改善對腦卒中等心腦血管疾病的治療效果，為此類藥物口服劑型的開發提供設計思路和實驗基礎。

1 材 料

1.1 試劑

三七總皂苷（PNS，南京景竹生物科技有限公司，純度85%）；玉米醇溶蛋白（東京化成工業株式會社）；蛋黃卵磷脂（安慶中創磷脂工程技術有限責任公司）；β-谷甾醇（阿拉丁試劑有限公司）；水合氯醛（上海凌峰化學試劑有限公司）；TTC染色試劑（北京謹明生物科技有限公司）；BCA蛋白含量檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術股份有限公司）；丙二醛（MDA）試劑盒、ELISA試劑盒（南京建成生物工程研究所）；甲醇、乙醇、乙腈均為色譜純，其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀器

Nano-ZSE激光粒度儀（英國Malvern公司）；SPARK酶聯免疫細胞儀（瑞士Tecan公司）；FV3000激光共聚焦顯微鏡（日本Olympus公司）；Accuri c6小型全自動流式細胞儀（美國Becton Dickinson公司）；H-7650透射電鏡顯微鏡（日本Hitachi公司）。

1.3 細胞及動物

人結腸癌細胞株Caco-2（江蘇凱基生物技術股份有限公司）。SPF級SD大鼠，雄性，體重（260±20）g，許可證號碼：SCXK（滬）018-0004，由南京青龍山動物繁育場提供，所有動物實驗均符合動物倫理委員會標準。

2 方 法

2.1 PLZ-NPs納米粒的制備和表征

根據本實驗已有經驗［16］采用反溶劑共沉淀法制備納米粒。精密稱取PNS、玉米醇溶蛋白、卵磷脂和β-谷甾醇（質量比12∶4∶3∶1）溶于適量80%乙醇，再趁熱分散于水中，攪拌至溶液呈白色乳光即得三七總皂苷玉米脂蛋白納米粒（PNS-lipid-zein nanoparticles，PLZ-NPs）。同樣的制備方法，不加入脂質制備三七總皂苷玉米蛋白納米粒（PNS-zein nanoparticles，PZ-NPs）；不加入PNS制備玉米脂蛋白納米粒（lipid-zein nanoparticles，LZ-NPs）；將異硫氰酸熒光素（FITC）代替PNS，制備得到FITC玉米脂蛋白納米粒（FITC-lipid-zein nanoparticles，FLZ-NPs）。

將納米粒溶液適當稀釋后，用激光粒度儀測定納米粒的粒徑、PDI以及Zeta電位，并用透射電鏡觀察形貌。

2.2 PLZ-NPs納米粒的細胞毒性和細胞攝取實驗

2.2.1 Caco-2細胞的培養 Caco-2細胞培養在含10%血清，1%非必需氨基酸，1%雙抗的DMEM培養基中，培養設置條件為37℃，5%CO2。

2.2.2 MTT法檢測PLZ-NPs納米粒的細胞毒性取對數生長期的Caco-2細胞接種于96孔板中并培養48 h后，分別與PNS、PLZ-NPs以及空白納米粒LZ-NPs共孵育4 h；之后加入1 mg/mL MTT溶液，繼續孵育4 h。孵育結束后加入二甲基亞砜（DMSO），酶聯免疫細胞儀在570 nm處測定各孔吸收度（A），通過計算得到細胞存活率。

2.2.3 激光共聚焦定性考察細胞對納米粒的攝取 將對數生長期的Caco-2細胞接種于共聚焦皿上，分別與游離的FITC、FLZ-NPs共孵育4 h。孵育結束后，用4%多聚甲醛固定細胞15 min，DAPI溶液0.1 mL染核15 min，激光共聚焦拍攝細胞攝取圖片。

2.2.4 流式細胞儀定量考察細胞對納米粒的攝取 將對數生長期的Caco-2細胞接種于12孔板中培養48 h后，分別與游離的FITC、FLZ-NPs共孵育1、2、4 h后，流式細胞儀定量測定細胞內的熒光強度。

2.3 納米粒的對大鼠腦缺血再灌注損傷的治療

2.3.1 MCAO法建立大鼠腦缺血再灌注模型 大鼠的腦缺血再灌注造模選擇雄性SD大鼠（260±20）g，術前禁食12 h，可自由飲水。3.3%水合氯醛（330 mg/kg）腹腔注射麻醉后，剪開頸部皮膚，鈍性分離肌肉組織并游離血管，自制栓線從頸外動脈沿著血管插入頸內動脈，直至腦內。大鼠缺血2 h后松動栓線恢復血液灌注，待完全清醒后，選擇有行為損傷的動物進行后續實驗［20-21］。隨機選擇建模成功的大鼠分為4組（n=5），假手術組（sham）只進行麻醉和血管分離，不結扎及導入線栓，灌胃給予生理鹽水；模型組（model）為成功建立缺血再灌注模型后，灌胃給予生理鹽水；游離PNS藥物組（PNSgroup）和制劑組（PLZ-NPs group）為成功建模后，分別灌胃游離PNS（200 mg/kg）和PLZ-NPs（含PNS為200 mg/kg）溶液。大鼠手術清醒后灌胃給藥，每天1次，連續3 d，最后1天給藥4 h后，處死大鼠并取腦組織進行后續實驗。

2.3.2 腦組織中相關指標的檢測[22-24]取新鮮的大腦組織，-20℃冷凍30 min后切成厚度2 mm左右的腦片，用2%的2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）溶液進行染色，正常腦組織染色后呈紅色，梗死區呈白色。取梗死對應側的腦組織，稱重后加PBS制備腦組織勻漿液，按試劑盒說明檢測蛋白質總含量、丙二醛（MDA）、以及ELISA試劑盒檢測TNF-α、IL-1β、Bcl-2和Bax的含量。

3 結果

3.1 PLZ-NPs的表征

如圖1-A～圖1-C所示，不加脂質的PZ-NPs在室溫下靜置2 h后明顯變得渾濁，溶液透光性下降，24 h后出現明顯的絮狀物沉淀；而PLZ-NPs無明顯變化，溶液的乳光和透光性良好，說明脂質的加入顯著提高了納米粒的穩定性。

PLZ-NPs的平均粒徑為（116.4±0.81）nm，PDI為0.048，Zeta電位為-（31.5±0.31）mV，結合圖1-D的TEM圖說明，PLZ-NPs的粒徑分布均一，無明顯的聚集狀態，圖1-E的標記處存在卵磷脂形成的“指紋結構”［25-27］。另外，PZ-NPs的Zeta電位為（17.6±0.7）mV，卵磷脂可通過靜電吸引等方式與PZ-NPs相互作用，最終改變了納米粒Zeta電位的正負值。綜上所述，合理推測PLZ-NPs是以玉米蛋白納米粒為內核，卵磷脂包裹在玉米蛋白納米粒外層的核殼型納米粒。

3.2 PLZ-NPs的細胞毒性和細胞攝取實驗

MTT法考察了納米粒的細胞毒性，從圖2-A可知，游離藥物PNS組、納米制劑PLZ-NPs組及空白載體LZ-NPs組的質量濃度為50~400μg/mL時，細胞存活率均在90%以上，當質量濃度提高到700μg/mL時，PLZ-NPs組和LZ-NPs組的細胞存活率仍在80%以上，表明PNS、卵磷脂、β-谷甾醇和玉米醇溶蛋白的細胞毒性較低，生物安全性良好。

Figure 1 Images of PZ-NPs(left)and PLZ-NPs(right)at 0 h(A),2 h(B)and 24 h(C);the TEMimagesof PLZ-NPs(D)and"fingerprint struc?ture"of PLZ-NPs(E)

流式細胞術定量檢測細胞內熒光強度的結果如圖2-B所示，細胞對FLZ-NPs的攝取量顯著提升，在1、2、4 h分別增加至游離FITC的620%、1 040%和1 760%，且呈現明顯的時間依賴性。

從圖2-C中的熒光強度可定性看出，Caco-2細胞對游離FITC和包載FITC的FLZ-NPs納米粒的攝取有較大差異，細胞對FLZ-NPs的攝取顯著增強。FITC和模型藥物PNS具有相似的親水特性，而細胞膜對脂溶性物質的親和力更強，而FLZ-NPs納米粒表面的脂質結構改善了FITC的親脂性，顯著提高了細胞的攝取。

3.3 大鼠腦缺血再灌注腦損傷的保護作用

從圖3-A可知，假手術組（sham）的腦組織呈正常的紅色；而用MCAO法成功建模后，模型組（model）在插入栓線側的腦組織出現白色梗死區，PNS和PLZ-NPs組的白色區域相對模型組均有減小，說明灌胃給予PNS和PLZ-NPs對大鼠腦損傷有一定的緩解作用。

缺血再灌注損傷通常會加劇代謝性氧化應激和破壞血-腦脊液屏障，最終造成繼發性腦組織損傷［28-29］，機體中過量的氧自由基會攻擊脂質生物膜中的多不飽和脂肪酸，導致脂質氧化生成一系列的脂質過氧化物，如MDA。另外，缺血再灌注后的腦細胞會受到損傷從而產生多種炎癥因子，如IL-1β和TNF-α等，因此檢測腦組織中的MDA、IL-1β和TNF-α的含量能夠間接反映細胞的損傷程度［30］。

Figure2 Cytotoxicity test and theuptakeassay in Caco-2 cellsby flow cytometry and laser confocal microscopy

如圖3所示，對比模型組，PNS組和PLZ-NPs組的MDA含量分別下降了約19.6%和33.11%，IL-1β含量分別下降了約20%和27.7%，TNF-α分別下降約13.0%和21.6%；相比PNS組，PLZ-NPs組的MDA含量下降了約16.8%，IL-1β和TNF-α的含量分別下降了約9.6%和9.9%。其中，PNS組和PLZ-NPs組的MDA和IL-1β含量經統計分析具有顯著性差異（P<0.05）。

Bcl-2蛋白是一種細胞存活的促進因子，Bax蛋白是與Bcl-2同源的水溶性相關蛋白，Bax基因是一種重要的凋亡基因，過度表達可拮抗Bcl-2的保護效應［22，31］。通過檢測腦組織中這兩種蛋白質的含量，能間接反映藥物對損傷的改善作用以及減少細胞凋亡的功效。從圖3結果可知，相比模型組，PNS組和PLZ-NPs組的Bax蛋白含量分別下降了約9.5%和18.5%，PLZ-NPs組比PNS組下降了約9.9%；Bcl-2的含量分別上升了約33.8%和58.8%，PLZ-NPs組比PNS組上升了約18.7%。其中，PNS和PLZ-NPs組的Bax含量具有顯著性差異（P<0.05）。以上結果表明，PNS和PLZ-NPs能有效改善腦缺血再灌注導致的損傷，對出現梗死后的腦組織具有一定的保護作用，且PLZ-NPs比PNS的作用更強。

4 討 論

玉米醇溶蛋白由于分子內部的疏水作用，可自組裝形成表面親水的球狀粒子結構，卵磷脂通過疏水鍵、氫鍵和靜電吸引等方式與其相互作用［32］，形成具有核殼型結構的PLZ-NPs納米粒，Zeta電位的改變和透射電鏡的考察結果也驗證了這一設想。

PZ-NPs溶液極不穩定，室溫下靜置2 h后出現明顯的渾濁，溶液透光性下降。推測由于玉米醇溶蛋白的等電點（pI=6.20）與PZ-NPs溶液的pH（pH 6.40）較為接近，導致蛋白分子之間的相互作用減弱，極易碰撞而產生聚集沉淀［33］，而卵磷脂的包封降低了分子間的相互作用，顯著提升了PLZNPs的穩定性。

Figure 3 Detections of PLZ-NPs for the treatment of cerebral ischemia-reperfusion injury in rats(xˉ±s,n=5)

MTT實驗表明，玉米脂蛋白納米粒的生物相容性良好，與Caco-2細胞共孵育后，能顯著提升細胞對親水性物質的攝取，且攝取量具有時間依賴性，這為PLZ-NPs促進腸上皮細胞對水溶性PNS的攝取和吸收提供了依據。

在藥效實驗中，相比模型組，PNS和PLZ-NPs組在TTC染色和MDA、IL-1β、TNF-α、Bax、Bcl-2的含量檢測中均有更好的表現，且PLZ-NPs的效果優于游離的PNS，推測玉米脂蛋白納米粒能有效促進腸道對藥物的攝取，顯著提高了體內的藥物濃度，從而改善了藥物對腦缺血再灌注損傷的保護作用。

本實驗證實了玉米脂蛋白納米粒能顯著促進細胞對親水性物質的攝取，改善PNS對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用，為此類中藥口服劑型的開發設計提供了思路與方法。