pH響應性PTEN/PLGA-(HE)10-MAP納米粒的構建及體外評價

雍 琴，岳瀚勛，石 敏，黃仕琴，趙 軒，余 嫻*

（1重慶醫科大學附屬第二醫院Ⅰ期臨床試驗研究室，重慶400010；2漯河市中心醫院藥學部，漯河462000；3重慶市江津區中心醫院藥學部，重慶402260）

惡性腫瘤是威脅人類健康的主要慢性非傳染性疾病。據GLOBOCAN全球腫瘤負擔狀況報告稱，2020年全球新發腫瘤病例大約1 930萬，腫瘤已成為21世紀全球各國家和地區的主要死因，嚴重阻礙人類預期壽命的延長［1-2］。免疫治療和基因治療作為新興腫瘤治療手段正在快速發展，基因治療是其中的重要組成部分［3］。腫瘤的發生極為復雜，基因治療針對其遺傳學背景，將具有治療潛力的外源性目的基因導入靶細胞內，以糾正過度活化的基因或補償缺陷的基因，從而達到抑制腫瘤生長、治療腫瘤的目的。抑癌基因是基因治療中相當重要的一類目的基因，其中第10號染色體同源缺失性磷酸酯酶-張力蛋白（phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10，PTEN）基因于1997年由Li等［4］研究原發性乳腺癌時分離得到，是第一個被發現具有雙特異性磷酸酶活性的抑癌基因。在前期研究中發現，PTEN表達下調與食管癌細胞分化程度、浸潤深度及淋巴結轉移密切相關，PTEN重組質粒DNA能在Eca109細胞中表達PTEN蛋白，發揮抑制腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡的作用［5-7］。但由于DNA類基因治療藥物存在難以被細胞攝取、難以在靶組織蓄積以及體內穩定性差等缺點，如何將基因安全、高效地導入靶細胞是基因治療亟待解決的科學問題［8］。

在基因治療中，利用納米技術賦予生物材料多功能性用于遞送基因藥物，能夠顯著增加藥物的溶解度、改善其生物利用度，提高藥物在體內的穩定性并降低不良反應［9］。聚乳酸-羥基乙酸共聚物［poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA］由一定比例的乳酸和羥基乙酸構成，其在體內的最終降解產物是二氧化碳和水，目前已被美國食品藥品管理局和歐洲藥品管理局批準用于藥物遞送［10］。引入具有不同功能的多肽例如細胞穿膜肽（cell-pen?etrating peptides，CPPs）、pH敏感肽作為作用片段，對納米材料進行特性改造，可有效提高基因的靶向導入效率。模型兩親性多肽（model amphipathic peptide，MAP）是由Steiner等［11］設計合成的一種兩親性CCPs，可通過內吞作用攜帶多種生物活性分子進入細胞。組氨酸-谷氨酸（histidine-glutamic acid，HE）重復寡肽是一段具有高度pH敏感性的多肽序列，運用生物技術融合得到pH響應性寡肽與CPPs的重組體（HE）10-MAP。在正常組織pH環境下，（HE）10可掩蔽MAP的陽離子電荷，使其喪失穿膜活性；而在腫瘤組織弱酸性微環境中，組氨酸質子化帶正電荷，MAP與谷氨酸之間的靜電作用被消除，穿膜活性得以恢復，可攜帶藥物進入細胞［12］。對于pH響應的CPPs遞送系統研究時間尚短，目前還未有該系統應用于載基因藥物的相關報道。

本研究將PTEN質粒DNA作為模型藥物，結合pH響應腫瘤靶向、CPPs遞送以及納米遞送系統的優勢，構建一種新型pH響應性多肽重組體修飾的納米粒藥物遞送系統PTEN/PLGA-（HE）10-MAP，其制備、結構及靶向作用示意圖如圖1所示，并對其進行體外評價，為研發具有臨床應用價值的基因藥物靶向遞送系統提供理論依據；為新型抗腫瘤基因藥物的研發提供新的策略。

1 材料

1.1 試劑

Figure 1 Schematic showing the formulation of PTEN/PLGA-(HE)10-MAPnanoparticles(NPs)and the mechanism of pH-sensitive internalization of histidine-glutamic acid-model amphipathic peptidenanocomplex[(HE)10-MAP]

PLGA［丙交酯-乙交酯（75∶25），Mr：20 kD，濟南岱罡生物科技有限公司］；（2，3-二油酰基-丙基）三甲基氯化銨［（2，3-dioleoyloxy-propyl）-trimethyl?ammonium-chloride，DOTAP，艾偉拓（上海）醫藥科技有限公司］；聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA，醇解度：摩爾分數87.0%～89.0%）、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽［N-（3-dimethylami?nopropyl） -N′-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC］、N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；CCK-8試劑盒（美國MedChemexpress公司）；4%多聚甲醛溶液（PFA，重慶賽米克生物科技有限公司）；Triton X-100（北京Biotopped科技有限公司）；Lipo8000TM轉染試劑、RIPA裂解液、PMSF、ECL發光液、PTEN兔單克隆抗體、GAPDH兔單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（H+L）（上海碧云天生物技術有限公司）；DAPI染液（重慶蒙博生物科技有限公司）。其他試劑均為市售分析純。

1.2 多肽、質粒及細胞

MAP（KLALKLALKALKAALKLA）、pH響應性寡 肽與CPPs的重 組體（HE）10-MAP［（HE）10G5KLALKLALKALKAALKLA）］［生工生物工程（上海）股份有限公司］；pEGFP-N2（EGFP）、pcDNA3、pcDNA3-PTEN（PTEN）質粒DNA由本實驗室保存［13-14］；人食管癌細胞Eca109、人正常結直腸黏膜細胞FHC、人正常肝細胞L-O2由本實驗室保存。

1.3 儀器

JY88-IIN超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Zetasizer Nano ZS90納米粒度電位儀（英國Malvern Panalytical儀器有限公司）；IX53倒置熒光顯微鏡（日本Olympus株式會社）；Varioskan LUX酶標儀，NanoDropTMOne超微量紫外-可見光分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

2 方 法

2.1 納米粒的制備及表征分析

2.1.1 納米粒的制備 采用雙乳化-溶劑揮發（W/O/W）法［15］制備PLGA納米粒：含PTEN質粒DNA 200μg的TE緩沖液（pH 8.0）200μL作為W1相；稱取DOTAP粉末10 mg、PLGA顆粒50 mg，加入二氯甲烷1 mL使二者溶解，以該混合溶液作為O相；以質量分數為2%的PVA水溶液3 mL作為W2相。將W1相緩慢滴入O相，冰浴超聲乳化2 min，功率55 W，超聲1 s暫停2 s，振幅35%，形成W/O型初乳溶液。沿管壁向該乳液中緩慢加入W2相，繼續冰浴超聲2 min形成W/O/W型復乳溶液，將復乳溶液逐滴加入至質量分數為1%的PVA水溶液8 mL中，常溫下恒速（500 r/min）磁力攪拌4 h以揮發除去有機溶劑。通過低溫高速離心（4℃，13 700 r/min，15 min）收集納米粒，繼而用適量無菌去離子水重懸洗滌3次后得到載PTEN質粒DNA的PLGA納米粒混懸液（PTEN/PLGA NPs）。同法制備未載質粒DNA的PLGA納米粒（PLGA NPs）。于-80℃放置至完全冷凍，真空冷凍干燥并稱重。

參考相關文獻［16］，通過酰胺縮合反應制備經多肽修飾的PLGA納米粒：取PLGA納米粒混懸液2 mL，于磁力攪拌器上，室溫條件下加入EDC 0.91 mg低速攪拌10 min后，加入NHS 1.09 mg避光攪拌30 min，活化羧基基團；繼而冰浴條件下加入過量的MAP或（HE）10-MAP，得到多肽修飾的載PTEN質粒DNA納米粒［PTEN/PLGA-MAP NPs或PTEN/PLGA-（HE）10-MAP NPs］及空載體納米粒［PLGA-（HE）10-MAPNPs］。避光低速攪拌過夜，使PLGA的羧基端與多肽的氨基端脫水偶聯；離心，洗滌3次以去除未結合的多肽，適量無菌去離子水（pH 6.5）重懸，置于4℃儲備待用。

2.1.2 納米粒的表征分析 取少許PTEN/PLGA-（HE）10-MAPNPs混懸液，使用無菌去離子水適當稀釋至澄清后，使用納米粒度電位儀測定其粒徑分布及pH 7.4、7.0和6.5條件下的Zeta電位。

利用紫外分光光度法測定離心后上清液中未包封質粒DNA的濃度，按照相關公式分別計算納米粒的包封率與載藥量。

2.1.3 納米粒的細胞毒性分析 取對數生長期的Eca109、FHC、L-O2細胞接種于96孔板中，37℃、5%CO2培養，待細胞貼壁生長至70%融合時，根據載藥量計算，按納米粒質量濃度梯度15、25、35、45 mg/mL加入空載體納米粒PLGA-（HE）10-MAPNPs，PBS組為空白對照，各組設置3個復孔，1個空白孔，分別培養24 h和48 h。棄去原培養基，每孔加入CCK-8試劑10μL及無血清培養基90μL，37℃繼續孵育2 h，置于酶標儀中測定450 nm處吸收度，計算細胞存活率。

2.2 PTEN質粒DNA抗Eca109腫瘤細胞增殖活性

利用轉染試劑Lipo8000TM轉染質粒進入細胞。取對數生長期Eca109細胞，接種到96孔板，細胞分組為：pcDNA3組（pcDNA3/Lipo8000TM），PTEN組（PTEN/Lipo8000TM）。質粒DNA質量濃度梯度為2、4、6、8、10μg/mL，以無血清RPMI 1640培養基為空白對照，各組設置3個復孔，轉染細胞后分別培養24，48，72 h，通過CCK-8試劑檢測吸收度，計算細胞抑制率。

2.3 納米粒的攝取表達

2.3.1 倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達 按照“2.1.1”項方法制備載表達綠色熒光蛋白的EGFP質粒DNA納米粒（EGFP/PLGA NPs、EGFP/PLGA-MAPNPs和EGFP/PLGA-（HE）10-MAP NPs）。取對數生長期的Eca109細胞，接種到24孔板，細胞生長融合度達70%時，分別使用裸EGFP質粒DNA（pEGFP）、EGFP/PLGA NPs轉染細胞，每孔加入質粒DNA的質量為1μg。PBS組作為空白對照，各組設置3個復孔。轉染48 h后，棄掉原培養基，用4%多聚甲醛溶液在室溫固定細胞20 min；用含0.5%Triton X-100的PBS在室溫通透化處理15 min；加入DAPI染色液室溫孵育染色15 min后觀察。細胞攝取熒光比例通過軟件Image J分析計算獲得。

2.3.2 Western blot檢測PTEN蛋白的表達 取對數生長期的Eca109細胞，接種到6孔板，待細胞貼壁生長至70%融合時，更換培養基為pH 6.5的RPMI 1640，PBS組為空白對照，pcDNA3/Lipo8000TM組為陰性對照，PTEN/Lipo8000TM組為陽性對照，實驗組加入PTEN/PLGA-（HE）10-MAP NPs。每孔質粒DNA質量濃度均為4μg/mL。48 h后加入RIPA裂解液4℃振搖裂解細胞，收集各組細胞裂解液，加入上樣緩沖液煮沸10 min，采用BCA法測定蛋白濃度。常規方法進行Western blot實驗，使用ECL化學發光試劑將清洗好的聚偏二氟乙烯膜顯影，檢測蛋白條帶。

2.4 納米粒的體外抗腫瘤作用

取對數生長期的Eca109細胞，接種到96孔板，當細胞生長至70%融合時，模擬腫瘤組織弱酸性微環境，更換培養基為pH 6.5的RPMI 1640，按所載質粒DNA質量濃度梯度4、6、8、10μg/mL分別加入PTEN/PLGA NPs和PTEN/PLGA-（HE）10-MAPNPs，以PBS組為空白對照，各組均設置3個復孔，繼續培養48 h后按照CCK-8試劑盒說明書檢測，計算細胞抑制率。

2.5 納米粒的體外靶向性

模擬正常組織和腫瘤組織微環境，分別調節RPMI 1640培養基的酸堿度為pH 7.4、7.0和6.5。取對數生長期的Eca109細胞接種于24孔和96孔板中，待細胞生長至70%融合。24孔板內，分別使用EGFP/PLGA NPs、EGFP/PLGA-MAP NPs和EGFP/PLGA-（HE）10-MAPNPs作用于細胞，每孔加入質粒DNA的質量為0.5μg，以PBS組為空白對照，作用48 h后，使用DAPI染液染色，觀察轉染效果；96孔板內分別利用PTEN/PLGA NPs、PTEN/PLGA-MAP NPs和PTEN/PLGA-（HE）10-MAP NPs轉染細胞，每孔質粒DNA終濃度為4μg/mL，以PBS組為空白對照，各組設置3個復孔，作用48 h后，按照CCK-8試劑盒說明書檢測，計算細胞抑制率。

2.6 統計學處理

實驗均至少重復3次，所有數據以xˉ±s表示，采用SPSS26.0統計軟件分析，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），兩獨立樣本均數間的比較采用LSD檢驗，以P<0.05為差異具有統計學意義。

3 結 果

3.1 納米粒的表征

3.1.1 粒徑、多分散系數及Zeta電位 采用動態光散射法測得PTEN/PLGA-（HE）10-MAPNPs的粒徑為（266.5±2.86）nm，粒徑分布符合良好的正態分布模式，多分散系數（polydispersity index，PDI）均值為0.231±0.01，說明粒徑分布集中均一。在pH 7.4、7.0和6.5條件下納米粒的Zeta電位分別為-（6.7±0.26）mV、+（0.7±0.22）mV和+（37.5±0.85）mV，隨pH的降低，Zeta電位由負逐步轉為正，表明制備的納米粒在弱酸性環境中穩定，且在一定pH范圍具有pH敏感性。

3.1.2 包封率與載藥量 使用紫外分光光度法檢測上清液中質粒DNA的質量，根據相關公式計算包封率和載藥量。測得納米粒的包封率為（80.6±6.11）%。1 mg PLGA納米粒載有質粒DNA的質量為（2 473.4±186.96）ng。表明制備的納米粒能有效封裝質粒DNA。

3.2 納米粒具有較低的體外細胞毒性

檢測空載體納米粒PLGA-（HE）10-MAPNPs對腫瘤細胞（Eca109）及正常細胞（FHC、L-O2）的毒性，結果如圖2所示。同PBS組相比，雖然部分濃度下PLGA-（HE）10-MAPNPs對細胞存活率的影響具有統計學差異（P<0.05），但在較高濃度下作用不同時間后細胞存活率仍在80%以上，說明細胞的生長狀態和數量未受明顯影響。這表明制備的納米粒細胞毒性較低，生物相容性良好。

3.3 PTEN質粒DNA可抑制腫瘤細胞Eca109的增殖

Figure 2 Cytotoxicity analysis of non-loading PLGA-(HE)10-MAPNPs in Eca109 cells(A,D),FHCcells(B,E)and L-O2 cells(C,F)for 24(A-C)and 48 h(E-F),respectively(±s,n=3)

如圖3所示，pcDNA3質粒DNA在不同濃度下均未表現出抗Eca109細胞增殖的能力，與之相比，PTEN質粒DNA自4μg/mL開始即明顯表現出抑制Eca109細胞增殖的作用（P<0.01），此時抑制率約為50%。隨PTEN質粒DNA濃度的增加，細胞抑制率顯著升高（P<0.05），當質量濃度達到10 μg/mL時抑制率達到約90%，表明PTEN質粒DNA可抑制腫瘤細胞Eca109的增殖且其抗增殖作用具有濃度依賴性，但未表現出明顯的時間依賴性。

3.4 納米粒可被細胞有效攝取表達

3.4.1 EGFP蛋白的表達情況 通過熒光染色法觀察綠色熒光蛋白在細胞內的表達與分布。如圖4所示，pEGFP組幾乎未見綠色熒光，轉染效率僅為（0.12±0.07）%；EGFP/PLGA NPs組可見明顯的綠色熒光，納米粒的轉染效率為（19.90±2.24）%，且細胞質、細胞核及綠色熒光蛋白共定位。提示構建過程中的超聲乳化步驟不會影響質粒DNA的活性，PLGA納米粒能顯著提高細胞對所包載質粒DNA的攝取表達。

3.4.2 PTEN蛋白的表達情況 采用Western blot檢測不同復合物轉染Eca109細胞后PTEN蛋白的表達。結果顯示PTEN/PLGA-（HE）10-MAPNPs組檢測到與PTEN/Lipo8000TM組一致的相對分子質量為54 kD的PTEN蛋白特異性條帶。如圖5所示，與PBS組和pcDNA3/Lipo8000TM組相比，PTEN/PLGA-（HE）10-MAP NPs組和PTEN/Lipo8000TM組PTEN蛋白的表達顯著增加（P<0.01），表明制備的載PTEN質粒DNA納米粒PTEN/PLGA-（HE）10-MAP可被細胞有效攝取并表達目的蛋白。

3.5 納米粒具有體外抗腫瘤作用

通過CCK-8法檢測弱酸性環境下PTEN/PLGA-（HE）10-MAPNPs抑制Eca109食管癌細胞增殖的能力，并考察（HE）10-MAP對PLGA納米粒抗腫瘤作用的影響。如圖6所示，在pH 6.5時，PTEN/PLGA NPs組具有較弱的體外抗腫瘤作用，而PTEN/PLGA-（HE）10-MAPNPs組表現出明顯增強的抗腫瘤活性（P<0.05），說明（HE）10-MAP增強了PLGA納米粒的抗腫瘤作用。其原因可能是在弱酸性環境中（HE）10-MAP提高PLGA納米粒的穿膜效率，導致PTEN蛋白表達增加，進而增強其抑制腫瘤細胞增殖的作用。PTEN/PLGA-（HE）10-MAPNPs組在質粒DNA質量濃度4μg/mL時抑制率達到50%，隨濃度的增加其抑制細胞增殖的作用增強（P<0.01），10μg/mL時抑制率超過80%，表明制備的載PTEN質粒DNA納米粒抗腫瘤作用具有濃度依賴性。

Figure3 Analysisof antiproliferativeactivity mediated by PTENin Eca109 cells(xˉ±s,n=3)

Figure 4 Expression of EGFPprotein transfected by NPs in Eca109 cells(Scale bar:200μm)

Figure 5 Western blot of PTEN protein in transfected cells under medium with pH 6.5(xˉ±s,n=3)

3.6 納米粒具有體外pH響應性靶向作用

Figure 6 Analysis of antiproliferative activity induced by PTEN-load?ed NPsin Eca109 cellsunder mediumwith pH 6.5(xˉ±s,n=3)

通過熒光染色法與CCK-8實驗共同驗證納米粒的pH響應性。使用熒光顯微鏡觀察各pH條件下載EGFP質粒DNA的不同納米粒對Eca109細胞作用48 h的轉染效果。如圖7所示，各納米粒組均可見細胞質、細胞核及綠色熒光蛋白的共定位，再次說明質粒DNA的結構特性未被破壞。如圖7-B所示，與PBS組相比，EGFP/PLGA NPs組可見少量熒光表達，但在不同pH條件下熒光強度基本無差異（P>0.05），說明pH不影響EGFP/PLGA NPs的攝取表達。在圖7-C中，相較于EGFP/PLGA NPs組，EGFP/PLGA-MAPNPs組在各pH條件下均表現出增強的熒光（P<0.05），但熒光強度在不同pH條件下差異無統計學意義（P>0.05），提示未融合（HE）10的MAP雖可提高PLGA納米粒的轉染效率，但并無pH特異性。在pH 7.4和7.0條件下，EGFP/PLGA-（HE）10-MAP NPs組 較EGFP/PLGA-MAP NPs組的熒光強度明顯減弱（P<0.05），在pH 6.5時的熒光表達則基本無差異，證實（HE）10在正常組織pH條件下可有效掩蔽MAP的穿膜活性。

Figure 7 Transfection effects of EGFP-loaded NPs with/without(HE)10-MAPin Eca109 cells under medium with different pH(xˉ±s,n=3)

制備的載PTEN質粒DNA納米粒具有一定的體外抗腫瘤作用，通過檢測細胞抑制率，側面反映納米粒在不同pH條件下的轉染效率。以pH 7.4條件下PBS組作為對照計算pH 7.0和6.5時PBS組的細胞抑制率，結果顯示不同pH條件下各PBS組的細胞抑制率差異無統計學意義（P>0.05），即調節酸堿度孵育48 h后細胞生存狀態基本未發生變化。如圖8所示，不同納米粒組的細胞抑制率結果與熒光染色的結果一致。PTEN/PLGA-MAPNPs組在各pH條件下的抑制率相較于PTEN/PLGA NPs組均顯著升高，但兩組納米粒的抑制率均未因pH的改變而有所變化（P>0.05），說明MAP的穿膜作用無pH靶向性。而在pH 7.4和7.0條件下，PTEN/PLGA-（HE）10-MAPNPs組的細胞抑制率明顯低于其pH 6.5時的抑制率（P<0.01），同時也分別低于PTEN/PLGA-MAP NPs組pH 7.4和7.0時的細胞抑制率（P<0.01）。上述研究結果進一步表明（HE）10-MAP在弱酸性環境中可恢復MAP的穿膜活性，從而提高所載藥物的轉染效率。

Figure 8 Analysis of antiproliferative activity of PTEN-loaded NPs with/without(HE)10-MAP in Eca109 cells under medium with different pH(xˉ±s,n=3)

4 討 論

根據特定的腫瘤微環境設計的刺激響應型納米遞送系統是提高腫瘤基因治療效率的有效途徑［17］。本研究以PTEN質粒DNA作為抗腫瘤的模型基因藥物，以Eca109細胞作為代表性腫瘤細胞進行體外抗腫瘤相關實驗。經驗證，PTEN蛋白的表達增加可抑制食管癌細胞Eca109的增殖。選用安全的PLGA作為載體材料，使用帶正電荷的陽離子化合物DOTAP形成反膠束修飾PLGA納米粒，實現質粒DNA的有效包封［18］。其中PLGA具有極高的生物安全性和良好的可塑可修飾性，作為納米粒載體可防止藥物降解、降低藥物毒性并減少刺激，且在反復給藥的情況下亦可隨人體代謝排出體外，而不會在體內蓄積［19］。針對腫瘤組織細胞外液pH（6.0~7.0）呈弱酸性的特性，選用pH響應性寡肽與CPPs的重組體（HE）10-MAP偶聯至其表面［20］，制備pH響應性PLGA納米粒以期實現靶向遞送抗腫瘤基因藥物的作用。其中MAP在多項研究中均表現出較其他常用CPPs更高的轉導效率和更佳的抗蛋白酶水解穩定性［21］。而在正常組織環境中，HE重復寡肽能夠掩蔽MAP的穿膜活性［22］。有研究表明，（HE）10-MAP具有高pH敏感性，在pH 6.5~7.5條件下，其凈電荷隨pH的降低由負轉正，其內化亦隨之大幅增加，在pH 6.5左右達峰值［23］。

制得的pH響應性多肽重組體修飾的載PTEN質粒DNA的PLGA納米粒PTEN/PLGA-（HE）10-MAP包封率在80%以上，對質粒DNA具有良好的包封效果；粒徑位于200～300 nm之間，PDI約為0.231，小于0.25，說明納米粒分布均勻［24］；細胞毒性實驗提示制備的納米粒遞送系統基本安全無毒。在pH 6.5時，Zeta電位約為+37.5 mV，大于+30 mV，說明制備的納米粒分散體系在弱酸性環境中具備靜電穩定性和空間穩定性［25］；同時Zeta電位隨pH的降低呈現由負到正的變化趨勢，表明納米粒具有pH敏感性，能很好地被腫瘤細胞攝取［26］。Western blot與CCK-8實驗結果均顯示納米粒在與腫瘤組織相似的弱酸性環境中可被有效攝取表達，且表現出顯著的抗腫瘤作用和pH靶向性。

為驗證納米粒可提高細胞對質粒DNA的攝取表達且具有pH響應性，制備偶聯/未偶聯（HE）10-MAP的載EGFP的PLGA納米粒，觀察其熒光表達情況。結果顯示，經PLGA納米粒包載的EGFP質粒DNA可在細胞內成功轉錄表達，納米粒的構建過程不破壞質粒DNA結構活性的完整性；偶聯（HE）10-MAP后仍可表達綠色熒光蛋白，且在弱酸性條件下表達增加，表面修飾（HE）10-MAP的PLGA納米粒具有靶向性且可顯著增加質粒DNA的轉染效率。

綜上所述，本研究成功制備具有pH腫瘤靶向性的PTEN/PLGA-（HE）10-MAP納米粒，并證實該納米粒是一種可行的基因藥物靶向遞送系統。但本研究僅進行了體外實驗部分，將在后續實驗中完善納米粒的體內實驗與評價，以期為進一步研發及臨床應用提供理論依據。