不同鏈長聚乙二醇修飾的香豆素6脂質納米粒對口服吸收的影響

戴江東，李會鵬，孫敏捷*

（1江蘇省建湖縣人民醫院，鹽城224700；2中國藥科大學藥劑系，南京210009）

口服給藥具有成本低、順應性高等優點，因而被廣泛的接受和使用。腸上皮絨毛的總面積可達30~400 m2，對藥物具有良好的吸收能力［1-2］。納米脂質載體（nanostructured lipid carriers，NLCs）由固態脂質和液態脂質共同組成，其作為新一代的載藥平臺被廣泛應用于口服藥物遞送，并且具有非常好的生物相容性和生物可降解性［3-4］。納米脂質載體可控的納米結構提供了更大更穩定的空間來容納藥物分子，從而最大限度地提高了載藥量并且同時保證了藥物在載體中的穩定性。

為了能夠達到好的口服治療效果，藥物遞送系統必須克服胃腸道黏液層的快速清除和滯留，并且迅速有效地穿過腸上皮細胞進入血液循環［5-6］。為了克服高黏彈性黏液層的阻礙從而提高藥物的口服生物利用度，黏膜穿透型納米載體（MPP）被開發并被廣泛使用。MPP通過非離子型長鏈聚合物的修飾使其具有快速穿越腸上皮細胞的能力［7］。MPP穿透黏液層后到達更深層的腸細胞部位并且均勻地分布在腸道細胞表面，從而能夠更好地提高藥物的口服生物利用度。

PEG作為一種電中性的親水性材料被廣泛應用于藥物遞送系統中，其能夠增加制劑在體內的滯留時間，減少制劑血液循環過程中的識別和降解。更為重要的是，納米載體通過一定量的PEG修飾能夠展現出快速的黏膜穿透能力［8］。納米載體通過表面PEG修飾可以提供“黏液惰性”界面可以最大化地減少納米粒與黏液層的黏附，提高了納米載體在黏液層的擴散［9-10］。然而在大多數情況下，經過PEG修飾的納米載體親水性表面往往會阻礙腸道上皮細胞對其吸收。因此研究MPP的表面親水性對胃腸道吸收的影響顯得尤為緊迫和重要。

本研究制備了3種不同鏈長PEG修飾的NLCs，以香豆素6作為熒光探針考察NLCs的體內外行為。對不同鏈長PEG修飾的NLCs的理化性質、體外穩定性、細胞毒性、細胞攝取和攝取機制進行了考察，為后續研究奠定了基礎。

1 材料

1.1 藥品與試劑

香豆素6（C6，純度大于98%）、三月桂酸甘油酯（日本TCI公司）；大豆卵磷脂（上海太偉藥業有限公司）；Labrafac CC（法國Gattefosse公司）；聚乙二醇（40）單硬脂酸酯（S40）、聚乙二醇（55）單硬脂酸酯（S55）和聚乙二醇（100）單硬脂酸酯（S100）（上海日光化學貿易有限公司）；其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀器

JY92型探頭超聲儀（寧波新芝科器研究所）；ZetaPALS型高分辨率電位及粒度分析儀（美國Brookheaven公司）；LC-10ATVP高效液相色譜儀、RF-10AXL熒光檢測器（日本島津公司）；H-7650透射電子顯微鏡（日本日立公司）；酶聯免疫測定儀（美國Thermo Scientific公司）；透析袋（截留相對分子質量8 kD，南京晚晴化玻儀器有限公司）。

1.3 細胞

人結腸癌腺癌細胞Caco-2細胞株購自中國科學院上海分院細胞庫。

2 方法

2.1 香豆素6熒光分析方法的建立

采用高效液相色譜法檢測香豆素6的濃度，色譜柱采用ODSDiamonsil-C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相采用甲醇-水（96∶4）；流速設定為1.0 mL/min；柱溫為35℃；檢測激發波長為465 nm，發射波長為502 nm；進樣量設定為20μL。通過制備質量濃度為2，5，10，25，50，100 ng/mL的系列標準液后進樣分析，以峰面積（A）對質量濃度（c，ng/mL）進行線性回歸，得到線性回歸方程及相關系數。并對其專屬性和精密度進行考察。

2.2 不同鏈長PEG修飾的NLCs的制備及處方研究

2.2.1 薄膜分散法制備NLCs 通過薄膜分散法制備NLCs［11］，將處方量的香豆素6（100μg）、大豆磷脂（262.5 mg）、三月桂酸甘油酯（21.9 mg）、Labrafac CC（65.6 mg）以及相同質量（占總質量20%）不同鏈長的PEG加入到乙醇-二氯甲烷（8∶2）10 mL混合溶液中。全部溶解后將其轉移到500 mL的茄型瓶中，37℃旋轉減壓成膜。之后繼續抽真空12 h以除盡有機溶劑。加入等滲磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4），37℃水合30 min，通過控制不同的超聲時間（超聲強度設為100 W，超聲1 s停2 s，90次為1個循環）得到粒徑相同的不同鏈長PEG修飾的NLCs。通過過膜法測定香豆素6的包封率［10］。空白NLCs按照上述相同的方法制備，區別在于不包載香豆素6探針。本文若無特殊說明，所制備的NLCs均包載香豆素6。

2.2.2 NLCs的理化性質表征 粒徑和Zeta電位的測定：將制備得到的NLCs稀釋一定倍數后用電位及粒度分析儀測定其粒徑、多分散系數和Zeta電位。

形態觀察：將制備的不同鏈長PEG修飾的NLCs稀釋一定倍數后滴于銅網上，放置形成薄膜，通過透射電子顯微鏡對NLCs的形態進行觀察。

2.3 NLCs的體外穩定性考察

考察不同鏈長PEG修飾的NLCs在模擬胃液、模擬腸液和等滲PBS中的穩定性。量取不同鏈長PEG修飾的NLCs100μL，將其重新分散至模擬介質5 mL中，測定不同時間下NLCs的粒徑和多分散系數變化。

2.4 水化層厚度的研究

水化層厚度通過Gouy-Chapmann理論計算和驗證［12］，具體公式為lnψ（L）=lnA-kL。該理論中NLCs的電位和水化層厚度呈線性關系，其中k=為電解質的物質的量濃度），A為Debye-Huckel參數，L為水化層厚度。通過測定NLCs在不同濃度NaCl中的電位，可得出NLCs的水化層厚度（以nm為單位）。

2.5 體外釋放實驗

采用動態透析法研究NLCs在等滲PBS溶液中的體外香豆素6的釋放行為。將制備的不同鏈長PEG修飾的NLCs各1 mL（其中香豆素6的最終質量濃度為1 000 ng/mL）裝入透析袋中（截留相對分子質量為8 kD），然后將透析袋置于等滲PBS80 mL中，設定轉速為250 r/min，溫度設定為37℃，考察NLCs的體外釋放研究，在規定的時間點（1，2，4，6，8，12，24 h）取樣1 mL，并立即加入新鮮的釋放介質1 mL，釋放的介質樣品通過有機溶劑萃取渦旋后12 000 r/min離心10 min，取上清液進樣，繪制釋放曲線。

2.6 細胞毒性實驗

Caco-2細胞的培養條件為含有10%的胎牛血清、1%非必需氨基酸、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的高糖DMEM培養基。待細胞生長到對數期時，以每孔1×104個細胞的密度接種于96孔板中，37℃孵育24 h后，加入不同鏈長PEG修飾的含有香豆素6的NLCs或空白NLCs，37℃孵育24 h，加入噻唑藍（MTT）溶液（5 mg/mL）10μL，37℃繼續孵育4 h。待棄去上清液后，加入二甲基亞砜（DMSO）150μL溶解藍紫色的甲瓚結晶，用酶聯免疫測定儀于570 nm測定吸收度。將非加藥孔作為對照。每個樣品做3個復孔，計算細胞存活率。

2.7 細胞攝取實驗

取對數期生長期的Caco-2細胞鋪于24孔板中，待細胞匯合度達到80%以上加入不同鏈長PEG修飾的NLCs。通過包封不同質量濃度香豆素6（50，100，150，200 ng/mL）的NLCs與細胞孵育相同的時間（設定為2 h）或者包封相同質量濃度香豆素6的NLCs（100 ng/mL）與細胞孵育不同時間（0.5，1，1.5，2 h）來考察NLCs的細胞攝取動力學。待細胞攝取結束后移去NLCs，用PBS清洗3遍通過胰蛋白酶消化后用流式細胞儀進行熒光強度的定量。同時采用激光共聚焦顯微鏡對NLCs的細胞攝取進行定性觀察。將不同鏈長PEG修飾的NLCs（香豆素6的質量濃度設定為100 ng/mL）與細胞在共聚焦皿上孵育不同時間后移去NLCs，并且加入多聚甲醛進行固定。待通過4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色后將細胞放置于激光共聚焦顯微鏡下進行圖片拍攝。

2.8 細胞攝取機制研究

為了研究不同鏈長PEG修飾的NLCs的細胞攝取機制，NLCs首先與不同通路抑制劑提前孵育30 min，分別為疊氮化鈉（細胞能量代謝抑制劑）、氯丙嗪（網格蛋白介導的內吞抑制劑）、制霉菌素（小窩蛋白介導的內吞抑制劑）、巨胞飲通路抑制劑阿米洛利（EIPA）和甲基-β-環糊精（MβCD，通過抑制膽固醇合成同時抑制網格蛋白和小窩蛋白通路）［13］。孵育2 h細胞攝取結束后通過流式細胞儀對NLCs的攝取進行定量測定。相對攝取指數（RUI）通過公式RUI=Fs/Fc×100%測定，Fs代表與不同攝取抑制劑共同孵育的NLCs的細胞攝取量，Fc代表與不含抑制劑共同孵育的NLCs的細胞攝取量。

3 結果與討論

3.1 香豆素6熒光分析方法

以峰面積（y）對質量濃度（x）繪制標準曲線得到回歸方程為y=54 205x-7 798（r=0.998），在2~100 ng/mL范圍內，峰面積與香豆素6的質量濃度之間具有良好的線性關系，并且測得的日間精密度和日內精密度良好。

3.2 不同鏈長PEG修飾的NLCs的處方工藝優化

以粒徑和多分散系數（PDI）作為指標，通過控制超聲時間，得出最優的制備工藝。由圖1可知，PEG40修飾的NLC（pNLC-EG40）和PEG55修飾的NLC（pNLC-EG55）隨著超聲時間的延長，納米粒的粒徑先減小然后保持不變，PDI呈現先減小后增加的趨勢。對于PEG100修飾的NLC（pNLC-EG100）來說，超聲時間對粒徑的影響較小，PDI呈現出先增加后減小的趨勢。由結果可知對于不同鏈長PEG修飾的納米載體，增加超聲時間對NLCs粒徑的影響較小；對于較短鏈長PEG（PEG40和PEG55）修飾的納米載體，增加超聲時間后其PDI會增加，表明較長的超聲時間對載體粒徑的均一性產生了破壞。PEG100修飾的脂質納米載體隨著超聲時間的增加PDI持續降低，表明增加超聲時間有利于較長鏈長PEG修飾的納米載體的粒徑保持均一。為了獲得粒徑相同的不同鏈長PEG修飾的NLCs，將NLC的制備工藝設定為1個循環（每個循環超聲90次，超聲1 s，停2 s），pNLC-EG40的制備工藝設定為2個循環，pNLC-EG55的制備工藝設定為1個循環，pNLC-EG100的制備工藝設定為5個循環。

Figure1 Optimization of nanoparticlespreparation by adjustingultrasonic time(100 W,90 times/cycle)(xˉ±s,n=3)

3.3 不同鏈長PEG修飾的NLCs的形態學觀察

最終制備的不同鏈長PEG修飾的NLCs的粒徑和電位以及包封率的結果見表1。通過動態光散射（DLS）測得NLCs的粒徑均在120 nm左右，從而排除了粒徑差異對NLCs口服吸收的影響。由于本研究采用了電負性的磷脂，因此NLCs的電位為負，NLCs的負電性能夠更好地增加其在體內的循環時間。圖2透射電鏡（TEM）圖片顯示制備的4種NLCs呈類心球結構，粒徑與DLS所測的粒徑大小基本一致。并且通過過膜法測定香豆素6的包封率均在90%以上。這表明香豆素6能夠大部分包載到NLCs中。

3.4 不同鏈長PEG修飾的NLCs的體外穩定性考察

如圖3所示，制備的4種NLCs在PBS緩沖液、模擬胃液和模擬腸液中粒徑均能保持穩定。通過PBS緩沖液模擬細胞的生存環境，通過模擬胃液來模擬胃內環境，通過模擬腸液來模擬腸道內環境，4種NLCs的粒徑在3種模擬液中均能保持不變，表明6 h內NLCs在胃和腸道中均能夠保持自身的穩定性。

Table 1 Physicochemical property of nanostructured lipid carriers(NLCs)(xˉ±s,n=3)

Figure 2 Transmission electron microscope(TEM)images of(A)uNLC,(B)pNLC-EG40,(C)pNLC-EG55 and(D)pNLC-EG100

3.5 不同鏈長PEG修飾的NLCs的水化層厚度研究

由公式lnψ（L）=lnA-kL對4種NLCs進行線性擬合得出相應方程。uNLC的方程為y=-0.391 7x+4.092 3（r=0.988）。pNLC-EG40的方程為y=-1.578 4x+3.501 6（r=0.961）。pNLC-EG55的方程為y=-2.188 2x+3.929 7（r=0.987 4）。pNLC-EG100的方程為y=-2.923 5x+3.817 8（r=0.939 6）。上述方程中，y為lnψ（L），x為k。其水化層厚度從小到大依次為uNLC、pNLCEG40、pNLC-EG55、pNLC-EG100（圖4）。由結果可知，隨著PEG鏈長的增加，水化層的厚度逐漸增大，表明不同鏈長的PEG成功地修飾到了NLCs的表面，同時也證明水化層厚度和PEG的鏈長成正比。

3.6 體外釋放試驗

體外釋放實驗如圖5顯示，4種NLCs在PBS緩沖液中24 h的累積釋放量均未超過5%。表明香豆素6的滲漏量很小，制備的4種不同鏈長PEG修飾的NLCs能夠有效包載香豆素6。結果同時表明，NLCs表面不同鏈長的PEG修飾對藥物的釋放影響很小，包載香豆素6的NLCs在體內循環中能夠保持相對穩定，避免了藥物傳遞過程中香豆素6的快速滲漏。同時也可以通過香豆素6的熒光示蹤NLCs的體內外行為。

3.7 不同鏈長PEG修飾的NLCs對Caco-2細胞的細胞毒性試驗

通過MTT實驗［14］考察了不同鏈長PEG修飾的空白和載有香豆素6的NLCs與Caco-2細胞孵育24 h之后的細胞存活率，如圖6所示。NLCs在200～3 000μg/mL的范圍內，細胞的存活率均大于80%，表明NLCs在使用的質量濃度范圍內對細胞不產生毒性。同時不同鏈長PEG修飾的NLCs的組間細胞毒性無明顯差異，表明NLCs具有好的生物相容性和生物安全性。

Figure3 Stability study of coumarin 6-loaded NLCs in PBS（pH 7.4）（A）,simulated gastric fluid（B），and simulated intestinal fluid（C）at 37°C

Figure 4 Curve of lnψ(L)to k for nanoparticles with different polyeth?ylene glycol coating length(xˉ±s,n=3)

3.8 不同鏈長PEG修飾的NLCs對Caco-2細胞的細胞攝取研究

Figure 5 In vitro release profiles of coumarin 6-loaded NLCs in PBS(xˉ±s,n=3)

由圖7所示，Caco-2細胞對4種NLCs的攝取均具有濃度和時間依賴性，并且pNLC-EG100在各個時間點以及不同濃度均展示出了較高的熒光強度，表明Caco-2細胞對其具有較高的攝取效率。圖8的激光共聚焦圖像顯示pNLC-EG100與其他NLCs組相比具有更高的胞內熒光強度。上述結果表明，S100修飾的NLCs是最佳的PEG修飾長度，能夠顯著提高Caco-2細胞對脂質納米載體的攝取和吸收。

Figure6 In vitro cytotoxicity of coumarin 6-loaded NLCs(A)and blank NLCs(B)with different PEGcoatingon Caco-2 cells(xˉ±s,n=3)

Figure 7 Cell uptake of coumarin 6-loaded NLCs with different concentrations of coumarin 6(A)and cell uptake of coumarin 6-loaded NLCs con?taining100 ng/mL of coumarin 6 at different timeintervals(B)(xˉ±s,n=3)

Figure8 Confocal laser scanningmicroscopy(CLSM)imagesof Caco-2 cell after incubation with different NLCs(100 ng/mL of coumarin 6)at 37°C for 2 h(Scale bar:50μm)

3.9 不同鏈長PEG修飾的NLCs的細胞攝取途徑研究

由圖9可知，甲基-β-環糊精（MβCD）通過抑制膽固醇的合成對細胞的攝取影響最大，表明膽固醇在NLCs的細胞攝取過程中起到了重要作用，同時，小窩蛋白通路抑制劑制霉菌素（nystatin）和能量抑制劑疊氮化鈉（NaN3）均對NLCs的攝取產生了抑制作用，表明Caco-2細胞對NLCs的攝取是由多種通路共同介導的。巨胞飲通路抑制劑阿米洛利（EIPA）對uNLC和pNLC-EG55產生了顯著的抑制作用（P<0.01），但對pNLC-EG40和pNLC-EG55無抑制效果，表明PEG鏈段長度會對納米載體的巨胞飲途徑的攝取產生影響。

Figure 9 Relative uptake efficiency of NLCs treated with various cel?lular uptake inhibitors in Caco-2 cells(xˉ±s,n=3)MβCD:Methyl-β-cyclodextrin;EIPA:ethylisopropyl-amiloride

4 結 論

本實驗通過優化制備工藝得到了一系列不同鏈長PEG修飾的NLCs。NLCs水化層厚度隨著PEG鏈長的增加而增大，并且不同鏈長PEG修飾的NLCs在PBS緩沖液和K-R液中粒徑均能保持相對穩定。體外釋放試驗表明，香豆素6的泄漏量很小，可以通過香豆素6的熒光來示蹤納米粒的體內外行為。MTT實驗表明，在要求的濃度范圍內空白載體和載藥載體均是安全無毒的；細胞攝取動力學實驗表明，4種NLCs的Caco-2細胞攝取均具有時間依賴性和濃度依賴性，并且pNLC-EG100表現出了更高的細胞攝取效率，該結果通過激光共聚焦實驗得到驗證。4種NLCs的細胞攝取是由多種通路共同介導的，并且膽固醇在細胞的攝取過程中起到了重要作用。以上結果表明，不同鏈長的PEG修飾的NLCs在細胞攝取水平上存在差異性，pNLC-EG100是最佳鏈長的PEG。同時還需要進一步的細胞實驗和動物實驗驗證該結論。