非編碼RNA與胰島素信號通路關系及其臨床應用

劉禹宏，張方方，劉建興，劉 悅，楊 悅，金 亮

（中國藥科大學生命科學與技術學院，南京210009）

糖尿病是一種由于胰島素抵抗、胰島素分泌不足或胰高血糖素分泌過多而引起的代謝性疾病［1］。根據國際糖尿病聯盟（International Diabetes Federation，IDF）提供的數據，截至2019年，全球糖尿病患者約有4.63億，其中90%為2型糖尿病（type 2 diabetes，T2D），而1型糖尿病（type 1 diabe?tes，T1D）和妊娠糖尿病僅占10%左右。預計到2045年，全球糖尿病患者將突破7億人［2］。胰島β細胞功能受損和某些外圍組織（肝、脂肪和肌肉）的胰島素抵抗是T2D發生的主要病理原因［3］。

隨著測序技術的發展和相關研究的不斷深入，大量非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）被證實與糖尿病的發病存在明顯的相關性。與健康人群相比，大量的ncRNA在糖尿病患者中的表達水平發生顯著變化，并通過調控胰島素信號通路參與糖尿病的發生和發展。已有研究證實多種類別的ncRNA在調控肥胖和糖尿病的過程中發揮著重要作用［4］。因此，本文將主要論述ncRNA在胰島素信號通路轉導中的作用機制及其在糖尿病治療診斷中的應用前景，以期豐富和完善糖尿病的發生、發展機制，并為其將來作為糖尿病治療藥物或診斷試劑提供理論依據。

1 ncRNA的概念及其作用機制

ncRNA是一類沒有或只有有限編碼能力的RNA，主要包括微小RNA（microRNA，miRNA）、長鏈非編碼RNA（longnon-codingRNA，lncRNA）、環狀RNA（circular RNA，circRNA）、轉運RNA（transfer RNA，tRNA）、PIWI相互作用RNA（PIWI-interacting RNA，piRNA）和核小RNA（small nucleolar RNA，snoRNA）［5］。研究發現，這些不同類型的ncRNA均不同程度的參與調節了糖尿病的發生發展，尤其 是miRNA［6-8］、lncRNA［9］和circRNA［10］。目 前關于miRNA的研究已經相對成熟，但是有關lncRNA、circRNA和其他類型的ncRNA的功能及作用機制的研究仍然有限。

1.1 miRNA

miRNA是一種長度為18~21 nt的ncRNA。其體內產生過程是由DNA聚合酶Ⅱ將miRNA基因從DNA轉錄為pri-miRNA，pri-miRNA經過兩次加工后將變成miRNA。眾所周知，miRNA通過與mRNA的3′UTR區進行完全或非完全互補配對結合來干擾靶基因的表達進而影響蛋白質的翻譯［11］。另外，miRNA可以與多個mRNA結合，使得miRNA具有廣泛調節基因表達的功能。目前有關miRNA調控糖尿病發生、發展的研究也較為成熟［6-7］，比如本課題組在最近的一項研究中發現，miR-802可以通過靶向神經源性分化1（neurogenic differentiation 1，NEUROD1）影響胰島素的轉錄和分泌［12］。

1.2 lncRNA

lncRNA是長度超過200 nt的不具有或者只有部分編碼能力的RNA，同樣具有調控基因表達的生物學功能。根據基因組上與蛋白編碼基因的位置關系，lncRNA主要分為5類：①正義lncRNA（sense lncRNA）；②反義lncRNA（antisense lncRNA）；③雙向lncRNA（bidirectional lncRNA）；④內 含 子lncRNA（intronic lncRNA）；⑤基因間lncRNA（long intergenic noncoding RNA，lincRNA）［13］。研 究 發現，lncRNA主要以下述方式調控基因的表達：①作為重要的調節因子影響編碼基因的表達；②參與染色質結構的開放，從而激活不同基因的轉錄；③通過與轉錄因子結合來阻止基因轉錄；④作為miRNA的分子支架競爭抑制miRNA與靶基因的結合。據報道，lncRNA比miRNA具有更好的組織特異性，這表明lncRNA作為生物標志物具有更小的風險和更高的診斷價值［14］。目前已經發現lncRNA在糖尿病的發生、發展中起著重要作用。本課題組前期研究工作也發現lncRNA胰島素轉錄 調 節 因 子（regulator of insulin transcription，ROIT）可以通過調節NK6同源框1（NK6 homeobox 1，NKX6.1）影響胰島素的轉錄［15］。

1.3 circRNA

circRNA是一種通過非經典反向剪接形成的具有環狀結構的非編碼RNA，由于沒有5′端帽子結構和3′端poly（A）結構，其比線性RNA具有更好的穩定性［16］。目前發現circRNA主要以以下3種形式參與基因的表達調控：①circRNA與核仁小RNA（small nuclear，snRNA）或RNA聚合酶Ⅱ相互作用來調節基因轉錄；②circRNA作為miRNA海綿抑制miRNA與其靶mRNA的結合；③circRNA與RNA結合蛋白（RNA binding protein，RBP）結合改變mRNA剪接模式及穩定性［17］。此外，由于cir?cRNA是mRNA的前體進行非典型的剪切產生，因此，circRNA的剪切形成也能直接影響親本基因mRNA的表達。已有研究表明某些circRNA能調控基因的表達和疾病的發生（例如糖尿病）［18-19］。

1.4 其他類型的ncRNA

眾所周知，tRNA主要作用是攜帶氨基酸進入核糖體，在mRNA指導下參與蛋白質的合成過程。在大多數細胞中，tRNA占總RNA的4%~10%，是一類相當穩定的RNA。然而越來越多的證據表明，在各種病理條件（比如糖尿病）下，tRNA的轉錄后修飾會失調甚至可能會被降解產生tRNA衍生片段（tRNA fragment，tRF）［20］。

除了miRNA、lncRNA、circRNA、tRNA之外，piRNA和snoRNA也是最近被發現的非編碼RNA。piRNA是一類近年在動物生殖系中發現的、長度約為24~35 nt的小分子ncRNA。piRNA含有2′-O-甲基修飾的3′端，并通過與PIWI亞家族的Argo?nautes蛋白發生相互作用進而使目標基因轉錄本沉默［21］。snoRNA是一類不具有poly（A）結構但具有5′端帽子結構、長度為65~300 nt的小分子ncRNA。snoRNA主要分為C/D盒snoRNA和H/ACA snoRNA兩種類型，其發揮的主要生物學功能是指導核糖體RNA（ribosomal RNA，rRNA）和snRNA的轉錄后修飾［22］。

2 ncRNA與胰島素信號通路

胰島素抵抗是糖尿病發生的一個重要因素。胰島素抵抗主要發生在特定的外周靶組織中，如肝臟、肌肉和脂肪組織，但也發生在胰島β細胞中［23］。胰島素信號通路是一條被嚴格調控的通路，胰島素信號傳導阻滯會導致胰島素抵抗進而促進糖尿病的發生、發展。越來越多的證據表明ncRNA能夠調節胰島素信號通路中各分子的表達和活性，從而控制信號傳導過程。

2.1 胰島素信號通路

胰島素與胰島素受體（insulin receptor，INSR）結合后激活的INSR信號會募集胰島素受體底物（insulin receptor substrate，IRS）家族的分子，盡管已知有6種IRS亞型，但在代謝過程中功能最強的是IRS1和IRS2［24］。IRS磷酸化后，IRS蛋白會募集磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）異二聚體，該異二聚體含有調節亞基p85和催化亞基p110。PI3K可進一步催化磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate，PIP2）產 生 磷 脂 酰 肌 醇-3，4，5-三 磷 酸（phosphatidylinositol-3，4，5-trisphosphate，PIP3），從而激活3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1（3-phosphoinositide dependent protein kinase 1，PDK1）和蛋白激酶B（rac-beta serine/threonine protein kinase，PKB，也稱作AKT）。PDK1與mTOR復合物2（mammalian target of rapamycincomplex，mTORC2）可以使AKT磷酸化從而變成活化狀態［25］。活化的AKT可以使TBC1域家族成員4（TBC1 domain family，member 4，AS160，也稱為TBC1D4）、糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β）、叉頭轉錄因子（forkhead box O，FOXO）的磷酸化水平改變。AS160可以促進葡萄糖轉運蛋白4（solute carrier family 2 member 4，GLUT4）的轉運和葡萄糖的吸收［26］。而GSK-3β和FOXO可調節糖異生與糖原的合成，與腫瘤、糖尿病等多種疾病有關［27-28］（圖1）。胰島素信號通路中關鍵基因的活性缺陷已被確定是糖尿病的發病原因之一，ncRNA被鑒定為調控胰島素信號傳導的有效調節劑。

圖1 胰島素信號通路示意圖

2.2 miRNA調控胰島素信號通路

在過去的幾年中，miRNA被認為是控制包括胰島素信號通路在內的許多信號通路的關鍵阻滯器。miRNA通過調節胰島素信號通路中關鍵基因的表達發揮作用，這在肝臟、肌肉和脂肪組織等多個胰島素靶器官中都得到了印證。

肝臟是人體重要的代謝器官，在糖脂代謝中有核心作用，肝臟胰島素抵抗是T2D的一個標志。在肝細胞中，可被胰島素激活的AKT蛋白主要抑制葡萄糖的產生和促進糖原的合成。研究發現，在HepG2人肝細胞中miR-424-5p與INSR的3′UTR序列能直接結合，miR-424-5p的過表達誘導了INSR基因轉錄水平和蛋白水平的降低［4］。此外，它提供的證據表明，經飽和脂肪酸（saturated fatty acid，SFA）處理的HepG2細胞以及高脂飲食（high fat diet，HFD）小鼠的肝臟中INSR蛋白表達減少，同時miR-424-5p的表達增加。這些數據表明，SFA誘導的miR-424-5p是通過靶向INSR基因來削弱胰島素信號傳導。Ono等［29］研究結果表明，在原代小鼠肝細胞中miR-222能直接靶向IRS1基因進而使AKT蛋白磷酸化減少，實現對胰島素信號傳導的負調節作用。活化的IRS2通過刺激PI3K/AKT途徑和GLUT4蛋白來促進葡萄糖吸收以調節葡萄糖穩態。Huang等［30］的研究發現，與對照組相比，過表達miR-221能降低HepG2細胞的葡萄糖攝取。與對照組相比，經0.8 mmol/L棕櫚酸（palmitic acid，PA）處理的HepG2細胞中的PI3K、AKT和GLUT4基因在轉錄水平表達下調，而miR-221表達上升。此外雙熒光素酶報告基因實驗證明miR-221能直接靶向PI3K基因，進而調節葡萄糖的穩態。因此在肝細胞中過表達miR-221會引起胰島素抵抗等肥胖相關代謝紊亂的發生。據報道，miR-499-5p能直接靶向磷酸酶-張力蛋白基因（phosphatase and tensin homolog，PTEN）。在T2D小鼠模型（例如Leprdb/db小鼠）的肝臟中miR-499-5p被下調，PTEN基因表達上調且有肝胰島素抵抗的跡象。在敲降miR-499-5p之后，PTEN蛋白的高表達導致AKT蛋白活性顯著降低，進而導致下游效應基因表達降低，從而導致胰島素信號轉導受損［6］。

肌肉是人體內最大的胰島素敏感組織，對全身新陳代謝非常重要。肌肉胰島素抵抗的特征是胰島素刺激下的葡萄糖攝取和利用受損。Zhu等［31］等發現Lin28/let-7軸能夠調節葡萄糖代謝，肌肉特異性Lin28a敲除小鼠或let-7過表達小鼠的葡萄糖耐量下降并發生胰島素抵抗。事實上，let-7可以直接靶向胰島素信號通路中多個基因，包括INSR和IRS2。

脂肪細胞是胰島素的靶器官之一。Teleman等［32］在2006年首次報告miRNA可通過調節外周靶組織的胰島素信號傳導來調節葡萄糖穩態。作者首先在果蠅脂肪細胞中發現了miR-278。與正常果蠅相比，miR-278-KO突變體果蠅具有更高的胰島素和更高的血糖，出現胰島素抵抗的癥狀。此外，作者還觀察到脂肪細胞中FOXO基因出現過度活化，這是胰島素信號轉導受損的典型結果。這些結果表明，miR-278具有調節脂肪細胞中胰島素信號轉導的功能，這促使更多科學家對miRNA調節外周組織胰島素敏感性的機制進行研究。

2.3 lncRNA調控胰島素信號通路

雖然僅有少數lncRNA被證實參與了胰島素信號通路的級聯過程（表1），但鑒于lncRNA具有較強的組織分布特異性，使得lncRNA對胰島素信號通路的調控機制受到越來越多研究者的關注。

表1 胰島素信號通路、糖尿病相關ncRNA的研究概況

Goyal等［33］發現通過高通量測序發現與正常小鼠相比，Leprdb/db小鼠肝臟中的lncRNA H19顯著下調。而在HepG2細胞和原代小鼠肝細胞中使用特異性siRNA抑制lncRNA H19的表達水平后會顯著增加糖異生相關基因［比如葡萄糖6-磷酸酶（glucose-6-phosphatase，G6PC），磷酸烯醇丙酮酸羧化 激 酶1（phosphoenolpyruvate carboxykinase 1，PCK1）和丙酮酸羧化酶（pyruvate carboxylase，PC）］的水平、損害胰島素信號傳導并增加FOXO1蛋白的核定位。

lncRNA H19除了能調控肝臟胰島素信號傳導，也能影響肌肉中的胰島素信號傳導。Gao等［34］發現lncRNA H19和let-7能在骨骼肌中調節胰島素信號通路。lncRNA H19的表達量在T2D患者的肌肉中顯著降低。由于lncRNA H19可以充當let-7的分子海綿，所以導致let-7在T2D患者的肌肉中生物利用度提高，從而使let-7靶標（例如INSR和IRS2）的表達降低，最終導致肌肉組織的胰島素敏感性受損。除此之外，肌肉中非糖尿病性的急性高胰島素血癥通過PI3K/AKT信號通路促進let-7生物合成，從而導致了lncRNA H19快速降解。該研究揭示了lncRNA H19和let-7之間的雙重負反饋回路，有助于精確調節骨骼肌中的葡萄糖穩態。

Degirmenci等［35］的研究證明lnc-ASIR（adipose specific insulin responsive）沉默后會導致脂肪細胞胰島素反應受損，這表明lnc-ASIR是脂肪細胞胰島素信號通路中的新型組成部分。此外，Ruan等［36］通過研究發現當用特異性抑制劑阻斷PI3K/AKT信號通路后，過表達lncRNA-p3134對胰島素分泌的促進作用明顯減弱，這證實了lncRNAp3134是通過PI3K/AKT/mTOR信號通路促進胰島素分泌。

2.4 circRNA調控胰島素信號通路

circRNA是缺乏5′帽子結構和3′poly（A）結構的共價閉合連續環狀RNA。該特點使circRNA非常穩定，并且對核酸外切酶和RNase R酶具有抵抗力。因此，近年來人們對circRNA給予了更多的關注，circRNA已被建議作為新一代的生物標志物和許多疾病的潛在治療靶標。

Cai等［37］研究發現過表達circHIPK3可促進HepG2細胞中脂肪沉積并使血糖上升。miR-192-5p是circHIPK3的潛在靶標，進一步的研究表明，circHIPK3通過調節miR-192-5p的表達來上調FOXO1從而損害胰島素信號通路、促進血糖升高和發生胰島素抵抗。值得一提的是，circHIPK3能作為miR-30a的分子海綿，阻斷miR-30a的作用，這表明circHIPK3在糖尿病視網膜病變中也發揮著一些作用［18］。除在肝臟中發揮作用外，也有研究報道了circHIPK3在胰腺中的作用：Stoll等［38］等發現，circHIPK3是胰腺里表達最豐富的circRNA之一，同時在Leprdb/db小鼠的胰島β細胞中其表達顯著下調，進而損害胰島β細胞對葡萄糖的耐受能力，并促進胰島β細胞凋亡。下調的circHIPK3損害胰島β細胞功能的作用機制主要是通過作為miRNA的分子海綿從而抑制AKT、肌侵蛋白（myotrophin，MTPN）、葡萄糖轉運蛋白2（solute carrier family 2 member 2，GLUT2，也稱為SLC2A2）等蛋白的表達。MTPN是控制胰島素分泌機制的重要組成部分；GLUT2是胰島β細胞攝取葡萄糖的重要轉運蛋白。

circRNA在肌肉胰島素抵抗和脂肪組織胰島素抵抗中的研究還鮮有報道。但Liu等［39］等發現，circ-016910能充當miR-574-5p的海綿，而miR-574-5p可以通過靶向有絲分裂原活化蛋白激酶激酶激酶9（mitogen-activated protein kinase kinase kinase 9，MAP3K9）和AKT3發揮其生物作用。MAP3K9是MAPK信號通路中上游的激酶分子，可以接受細胞膜受體的多種信號刺激，激活后使下游基因磷酸化，調控細胞增殖分化。AKT3蛋白是哺乳動物細胞中AKT蛋白家族的成員，其他兩個功能緊密相關的同工酶是AKT1和AKT2［40］。AKT蛋白家族調控了許多重要的生物學過程，例如細胞凋亡和細胞增殖。另外，circRNA-TFRC也被發現與胰島素抵抗有關，circRNA-TFRC過表達會增加糖尿病等代謝疾病的風險［41］。

2.5 其他類型ncRNA

盡管tRNA、piRNA、snoRNA直接作用于胰島素信號通路的研究還鮮有報道，但是已經有一些關于這些類型ncRNA在代謝性疾病中的生物學功能和發病機制的研究（表1）。

tRNA突變、tRNA修飾異常、tRNA氨酰化異常均會加速糖尿病的發生與發展。tRNA修飾可能影響tRNA的穩定性、功能以及翻譯準確性和效率，因此tRNA修飾缺陷可能對蛋白質合成產生深遠的影響［20］。Cdkal1能對tRNA進行特異性修飾。Wei等［42］等研究發現胰島β細胞特異性Cdkal1基因敲除小鼠的胰島素原合成異常，同時葡萄糖耐量明顯降低、胰島素分泌明顯受損，這表明Cdkal1在蛋白質翻譯的質量控制中具有關鍵作用，并且與糖尿病的發生與發展有關。

Henaoui等［43］通過微陣列技術發現大鼠胰島中有大量piRNA的表達，隨后作者選擇了兩條在Goto-Kakizaki大鼠中高表達的piRNA（DQ732700和DQ746748），分別將這兩條piRNA在對照大鼠的胰島中高表達后導致葡萄糖耐量缺陷，這提示piRNA可能參與了糖尿病的發生與發展。

除了piRNA，也有少量文獻報道了snoRNA在糖尿病中的作用。Lee等［44］發現蛋白質編碼基因Rpl13a的內含子會產生的4個影響葡萄糖和胰島素穩態的snoRNA（U32a、U33、U34和U35a）。在小鼠中有選擇地刪除該4個snoRNA后，與對照小鼠相比，Rpl13a snoRNA的丟失改變了線粒體的代謝，降低了活性氧的張力，導致胰島β細胞在葡萄糖刺激下的胰島素分泌增加，葡萄糖耐量上升。

3 ncRNA作為治療糖尿病的潛在靶點及診斷標志物

3.1 ncRNA作為治療糖尿病的潛在靶點

越來越多的證據表明，不同類別的ncRNA直接參與了胰島素信號通路、胰島功能的控制和糖尿病的發生。事實上，在動物模型中改變選定的ncRNA在體內的含量可以成功地預防或治療糖尿病［45］。因此，ncRNA具有很強的治療潛力，是設計治療糖尿病有吸引力的潛在靶點。然而，將調節ncRNA的體內水平這一策略應用在人類身上仍有很大缺陷。調節ncRNA體內水平的常見方法是將模擬或阻斷所選ncRNA的寡核苷酸衍生物以各種方式送入體內。雖然這些分子可以通過被修飾以增加它們的穩定性并促進它們在組織內的轉移，但這些分子仍不能特異性地針對選定的細胞或組織。因此，這種方法可能會導致十分嚴重的不良反應，但ncRNA在糖尿病的治療方面仍具有一定的潛力。據報道，miR-802在肥胖小鼠中表達升高并與糖尿病的發生與發展有關，當將小鼠的miR-802基因敲除后能抵抗高脂飲食誘導的胰島素抵抗從而改善小鼠葡萄糖耐受性［11］。因此，需要找到更高效、更安全的方法能夠將選定的ncRNA衍生物輸送進入目標細胞或組織，這將有望為ncRNA治療糖尿病開辟新道路。

3.2 ncRNA作為治療糖尿病的潛在診斷標志物

雖然目前用ncRNA治療糖尿病仍有巨大挑戰，但是由于ncRNA具有穩定、易于在不同的體液中檢測到的特點，ncRNA已經被認為是一類新的臨床診斷標志物。Zhao等［46］等通過對正常人與糖尿病患者外周血中circRNA進行微陣列分析，發現hsa_circ_0054633表達水平變化較大，可能具有診斷能力。隨后在糖尿病前期組、糖尿病患者組、健康對照組中測試hsa_circ_0054633的診斷能力，結果表明hsa_circ_0054633有望成為診斷糖尿病的生物標志物。

4 總結與展望

前期研究人員所做的工作為ncRNA能夠調控胰島素信號通路及糖尿病的發生與發展提供了有力的證據。值得注意的是，ncRNA除了能獨立地在多個代謝器官中發揮作用外，不同類別的ncRNA之間也存在著相互作用。隨著糖尿病分子機制研究的不斷深入，糾正失調ncRNA水平的治療策略研究也逐步在動物實驗中展開。目前，已有研究人員使用miRNA模擬物或miRNA抑制劑來調節疾病條件下miRNA的表達［47］。但由于ncRNA輸送系統的高度限制性，相應策略還未能應用于臨床。因此，研發出安全高效的ncRNA輸送系統是研發ncRNA相關藥物的重要任務之一。