溴結構域蛋白4的抑制策略及其在腫瘤治療中的研究進展

劉曉慶，梁 爽，劉永軍，張 娜

（山東大學藥學院，天然產物化學生物學教育部重點實驗室，濟南250012）

表觀遺傳調控是一種不涉及DNA序列改變的基因表達調控方式，在腫瘤的發生、發展和轉移中發揮重要的作用，包括DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA及染色質重塑等［1-2］。其中，組蛋白修飾構成了一類超越基因序列的組蛋白密碼，控制著遺傳信息的表達。組蛋白賴氨酸乙酰化是組蛋白尾部的主要修飾之一，乙酰化賴氨酸的識別是其參與表觀遺傳調控的關鍵步驟［1，3］。溴結構域是組蛋白中乙酰化賴氨酸的“閱讀器”［1］，存在于8個亞家族的46種蛋白質中［4］。其中，溴結構域蛋白4（bromodomain-containing protein 4，BRD4）是溴結構域和超末端結構域家族中最重要的蛋白，與其他3個成員BRD2、BRD3和BRDT相比，BRD4研究最為廣泛［5］。BRD4在多種腫瘤細胞中過度表達［6-7］，識別組蛋白乙酰化賴氨酸并與之結合，招募染色質調控因子，促進基因轉錄，促進腫瘤的發生、發展和轉移［8］。因此，開發BRD4的抑制策略是表觀遺傳藥物研究中極為重要的一部分。

1 BRD4的結構及在腫瘤中的作用

1.1 BRD4的結構

BRD4由兩個保守的溴結構域（BD1、BD2）和一個超末端結構域（ET）構成［1］，根據氨基酸鏈的長度可分為3個亞型（圖1-A），分別為富含脯氨酸結構域的長亞型BRD4A和短亞型BRD4B、BRD4C［5］。溴結構域由4個反向平行的α螺旋αZ、αA、αB和αC構成，形成ZA環和BC環（圖1-B）［9］。兩個環中的氨基酸殘基形成一個疏水空腔，可識別并以氫鍵形式結合乙酰化賴氨酸殘基，進而調控相關功能。BRD4被形象地稱為乙酰化賴氨酸表觀遺傳“閱讀器”［10］。

1.2 BRD4在腫瘤中的作用

BRD4在多種腫瘤中過度表達，如黑色素瘤、卵巢癌等［6-7］，促進腫瘤的發生、發展和轉移。BRD4在腫瘤中的作用主要有：①促進c-Myc基因、B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）基因等的轉錄，促進腫瘤細胞增殖；②上調腫瘤細胞中PD-L1的表達，加劇免疫抑制；③修復損傷DNA；④促進端粒延伸。

BRD4識別染色質上乙酰化的組蛋白賴氨酸，并作為支架將RNA聚合酶Ⅱ、正性轉錄延伸因子b、轉錄中介體亞基等募集到活性基因的啟動子和增強子上，刺激轉錄的起始和延伸［11］。BRD4驅動C-MYC、BCL-2等關鍵致癌基因的轉錄，使其過度表達，從而加速腫瘤增殖和發展［12］。還可與多種G1基因啟動子結合來刺激G1基因表達，調控細胞周期，促進細胞增殖［13］。另外，BRD4在腫瘤細胞的CD274基因（編碼PD-L1）啟動子處富集，促進CD274基因轉錄而上調PD-L1。BRD4基因敲除可有效降低BRD4和PD-L1表達，表明BRD4與腫瘤細胞PD-L1水平的增加息息相關，BRD4會加劇腫瘤的免疫抑制［14］。Andrieu等［15］證實BRD4能調節三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）PD-1/PD-L1軸，上調T細胞PD-1和TNBC細胞PDL1的表達，促進腫瘤免疫逃逸。

BRD4不僅是DNA修復系統中多種基因的主調控子，激活DNA損傷檢查點，還以轉錄獨立的方式修復損傷DNA［16］。C-末端結合蛋白相互作用蛋白（C-terminal binding protein interacting protein，CtIP）是受損DNA同源重組修復的關鍵蛋白，BRD4通過調控CtIP表達，促使腫瘤細胞修復損傷DNA［17］。乙酰化組蛋白在損傷的DNA處聚集并招募BRD4，BRD4作為支架穩定P53結合蛋白53BP1，進而激活損傷DNA的修復和組裝［18］。因此，抑制BRD4可導致或加劇DNA損傷，為腫瘤治療提供了新的思路。端粒長短影響細胞增殖速度。端粒上積累的乙酰化組蛋白招募BRD4，促進端粒保護復合物的組裝，增強端粒酶活性，從而促進端粒延長，加速腫瘤增殖［16，19］。

Figure 1 Structures of bromodomain-containing protein 4(BRD4)(A)[5]and crystal structure of bromodomain(B)[9]

2 BRD4的抑制策略

BRD4對腫瘤發生發展的促進作用使其成為腫瘤治療中極具研究價值的靶點之一。采用合適的策略抑制腫瘤細胞中過度表達的BRD4，是腫瘤治療新的切入點。研究表明，多種BRD4抑制劑和BRD4降解劑均具有良好的抗腫瘤效果。

2.1 BRD4抑制劑

近年來，大量BRD4抑制劑被開發出來，代表性BRD4抑制劑的化學結構見圖2。已有多種處于臨床試驗階段（表1），表現出良好的應用前景。根據BRD4抑制劑與溴結構域的相互作用方式，可將其分為兩類：一價型和二價型。一價型BRD4抑制劑與單個溴結構域結合，而二價型BRD4抑制劑能夠同時結合兩個溴結構域。

Figure2 Structures of some BRD4 inhibitors and crystal structure of JQ1-BRD4

Table 1 BRD4 inhibitors in clinical trails[4,8,11]

目前，一價型BRD4抑制劑最為常見。Beren?guer-Daizé等［20］發 現 三 氮 唑 類BRD4抑 制 劑OTX015可導致細胞周期阻滯，抑制腫瘤細胞增殖，經口給予OTX015可顯著提高U87MG異種移植小鼠的存活率。在OTX015的血液惡性腫瘤Ⅰ期臨床試驗中（NCT01713582），口服劑量從10 mg/d增加到160 mg/d（3周為一療程，前2周給藥），最終確定了其安全給藥劑量為80 mg/d，作為Ⅱ期臨床試驗的推薦劑量［21］。治療過程中，部分患者出現血小板減少、胃腸道毒性、膽紅素升高、疲勞等輕中度不良反應［21］。這些不良反應是可控的，且隨著治療的中斷而消退。TEN-010的Ⅰ期臨床試驗（NCT01987362）采用皮下給藥方式，劑量從0.03 mg/kg增加到0.85 mg/kg（3周為一療程，前2周給藥）。接受高劑量治療（0.45 mg/kg）的患者均有不同程度的腫瘤消退。CPI-0610是一種異噁唑類BRD4抑制劑，已經完成多發性骨髓瘤、淋巴瘤的Ⅰ期臨床試驗，與魯索替尼聯合治療多種腫瘤的Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗正在進行中。在CPI-0610的淋巴瘤Ⅰ期臨床試驗中（NCT01949883），評估了從6 mg/d增加到300 mg/d（3周為一療程，前2周給藥）的口服劑量。結果顯示，CPI-0610耐受性良好，最大耐受劑量是225 mg/d，不良反應與OTX015類似，在晚期淋巴瘤患者中具有抗腫瘤活性［22］。在多發性骨髓瘤細胞中，CPI-0610抑制Ikaros家族鋅指蛋白1、干擾素調節因子4和致癌基因MYC的表達，通過G1細胞周期阻滯和半胱氨酸蛋白酶依賴的凋亡途徑對腫瘤細胞產生強大的毒性［23］。

AZD5153是一種新型二價型BRD4抑制劑，可同時結合BRD4中的兩個溴結構域，具有更強的抗腫瘤活性，正在進行Ⅰ期臨床試驗（NCT03205176、NCT03527147）。AZD5153抑制Myc、E2F和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamy?cin，mTOR）信號通路，在急性髓系白血病、多發性骨髓瘤和淋巴瘤的異種移植模型中顯著抑制腫瘤生長［24］。Shen等［25］發現，AZD5153下調前列腺癌細胞中細胞周期蛋白D1（cyclin D1）、Myc、Bcl-2、FOS樣抗原1（FOSL1）和細胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）的表達，引起細胞周期阻滯和細胞凋亡。進一步研究表明，蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）是AZD5153的主要耐藥因子，AZD5153處理前列腺癌異種移植小鼠可抑制腫瘤的生長，聯合AKT抑制劑MK-2206可進一步增強抗腫瘤活性。另外，AZD5153可下調腫瘤相關巨噬細胞上PD-L1的表達，并使其從M2型向M1型轉化，同時增強CD8+T細胞的活化，從而重塑卵巢癌中的免疫微環境［26］。

BRD4抑制劑競爭性結合BRD4的乙酰賴氨酸結合位點，阻斷BRD4與組蛋白乙酰化賴氨酸的結合，拮抗BRD4對腫瘤發生發展的促進作用。2010年，Filippakopoulos等［9］報道了第1個三氮唑類BRD4抑制劑JQ1，它在多項研究中均表現出良好的抗腫瘤活性，Maggisano等［27］制備了包載JQ1的聚乳酸-羥基乙酸共聚物納米粒N-JQ1。用N-JQ1處理三陰性乳腺癌細胞后，可顯著降低細胞活力，減少細胞遷移。為了改善JQ1半衰期短的問題，研究人員對其叔丁酯基進行結構修飾，得到一系列藥效持久且抑制活性較好的BRD4抑制劑。三氮唑 類BRD4抑 制 劑（JQ1、OTX015、TEN-010、IBET762等）三氮唑環上的3位氮原子與乙酰化賴氨酸識別口袋的Asn140以氫鍵方式結合，2位氮原子與Tyr97通過水分子以氫鍵相連，氯苯基位于WPF區域（ZA環、BC環和αZ形成），通過疏水作用與BRD4結合［1，3］（圖2）。研究表明，該類抑制劑三氮唑環上的3位氮原子與Asn140形成氫鍵是BRD4抑制活性所必需的；三氮唑環上的甲基作為最優基團與BRD4的甲基疏水空腔結合，若以其他基團取代，與BRD4的結合能力則大大下降；氮雜?環上的側鏈也會影響化合物與BRD4的結合能力［28］。氯苯基是與WPF區域結合能力最好且有較低不良反應的官能團，決定了BRD4抑制劑對BRD4的選擇性。基于此，以對羥基苯羧酰胺取代JQ1氮雜?環上的叔丁酯側鏈，得到OTX015，其IC50為92～112 nmol/L，抑制活性較JQ1（IC50為77 nmol/L）略有降低，但半衰期有所延長［8］。以酰胺替換酯基，化合物的抗水解能力增強，TEN-010和I-BET762的穩定性較JQ1大大提高。此外，IBET762稠合芳環上的甲氧基也關系著與BRD4的結合能力。

異噁唑類BRD4抑制劑（CPI-0610，PLX51107等）的異噁唑環上的氧原子與Asn140以氫鍵方式結合，所以該氧原子是BRD4抑制活性所必需的。CPI-0610對BD1的IC50為39 nmol/L，具有良好的藥代動力學參數；PLX51107與BD1或BD2結合，Kd分別為1.7 nmol/L和6.1 nmol/L，是一種有效的BRD4抑制劑［4］。PFI-1是一種喹啉酮類BRD4抑制劑，喹啉酮中的羰基氧及氮氫同時與Asn140形成氫鍵，從而與BRD4結合。PFI-1對白血病細胞具有活性，但其有效性比JQ1低［8］。Gosmini等［29］經構效關系分析，得到抑制活性很強的四氫喹啉類BRD4抑制劑I-BET726，其乙酰基上的氧、羧基分別與Asn140、Tyr97形成氫鍵，此外，甲基的構象也對BRD4抑制活性影響較大。I-BET726可強效抑制神經母細胞瘤細胞的增殖，IC50為75 nmol/L［29］。乙酰吡咯類BRD4抑制劑（如XD14）與BRD4的作用方式與上述各類抑制劑略有不同，XD14的羰基氧與Asn140和Tyr97形成氫鍵，吡咯環的氮原子與Pro82以氫鍵結合，苯磺酰胺與WPF區域形成CH-π共軛，增強了與BRD4的結合能力［3，8］。Tanaka等［30］以聚乙二醇將兩個JQ1分子連在一起，開發了一種二價型BRD4抑制劑MT1，其對BD1的IC50為0.789 nmol/L，大大提高了抗腫瘤活性。

2.2 BRD4降解劑

BRD4降解劑可有效誘導BRD4降解，在抑制腫瘤細胞生長和促進細胞凋亡方面比相應的BRD4抑制劑更有效，是一種極具前景的BRD4抑制策略。基于蛋白水解靶向嵌合分子（protein proteolysis-targeting chimeras，PROTACs）技術開發的BRD4降解劑由3部分組成：BRD4抑制劑、E3泛素連接酶配體和連接鏈［31］。BRD4降解劑分別與BRD4和E3泛素連接酶結合，形成一種三元復合物，誘導BRD4泛素化，進而使BRD4被蛋白酶體降解，發揮抗腫瘤作用［4］（圖3）。近年來，研究人員設計出一系列BRD4降解劑（圖4），根據E3泛素連接酶的類型，可將其分為兩類：基于CRBN（Cul4-Rbx1-DDB1-cereblon）的BRD4降解劑和基于VHL（Von Hippel-Lindau）的BRD4降 解劑［4］（表2）。

基于CRBN的BRD4降解劑主要有dBET1和ARV-825等。dBET1是由JQ1和沙利度胺合成得到的，以人白血病細胞MV4-11荷瘤小鼠為模型評價其體內效果，發現可顯著抑制腫瘤生長［32］。ARV-825是由OTX015和泊馬度胺（pomalidomide）合成的另一個BRD4降解劑，研究表明ARV-825可將BRD4招募到E3泛素連接酶上，使Burkitt淋巴瘤細胞中的BRD4快速降解，抑制下游c-Myc表達，且與OTX015相比，其抑制增殖和誘導凋亡的能力更強［33］。He等［34］研究發現，ARV-825可誘導甲狀腺癌細胞中BRD4蛋白降解進而下調c-Myc、Bcl-xL和cyclin D1的表達。體內研究表明，經口給予ARV-825能顯著抑制TPC-1異種移植小鼠腫瘤的生長。最近，基于光控釋放的新型BRD4降解劑受到研究人員青睞。Xue等［31］和Liu等［35］將4，5-二甲氧基-2-硝基芐基鹽酸鹽作為光活性部分修飾到dBET1上，分別得到化合物pc-PROTAC和optodBET1，實現了dBET1在365 nm光照下的特異性釋放，以減輕全身給藥時的不良反應。這為新型BRD4降解劑的開發提供了重要參考。

以腫瘤抑制蛋白VHL為E3泛素連接酶設計的BRD4降解劑也具有良好的抗腫瘤效果。MZ1由JQ1和VH-032連接而成，與dBET1相比，它可優先降解BRD4，表現出良好的選擇性。Raina等［36］利用OTX015和VHL-2合成得到另一種BRD4降解劑ARV-771。在去勢抵抗前列腺癌細胞中，ARV-771降解BRD4，抑制雄激素受體FL-AR和AR-V7的表達。體內抑瘤實驗表明，ARV-771可抑制22Rv1異種移植小鼠腫瘤的生長。Sun等［37］研究發現ARV-771對BRD4的降解能力比ARV-825更強，且與OTX015相比，ARV-771能顯著延長套細胞淋巴瘤MCL Z138異種移植小鼠的生存期。

3 在腫瘤聯合治療中的應用

抑制BRD4可抑制腫瘤細胞中關鍵基因的轉錄，阻止DNA損傷修復，下調PD-L1表達，從而抑制腫瘤的增殖和轉移。多項研究表明，將BRD4抑制策略與其他治療方法聯合應用，協同不同的治療機制，產生更好的治療效果（圖5）。

3.1 BRD4抑制與化學治療

Figure3 Mechanism of BRD4 degraders[4,31]

Figure 4 Structures of some BRD4 degraders

Table 2 BRD4 degraders and their components

化療藥物直接殺傷腫瘤細胞，在臨床腫瘤治療中應用廣泛。BRD4抑制劑與化療藥物聯用，是一種極具臨床治療潛力的策略。烷化劑破壞腫瘤細胞DNA，BRD4抑制劑阻止DNA損傷修復，二者聯合使用，可加劇DNA損傷。Lam等［38］開發了一種共載替莫唑胺和JQ1的轉鐵蛋白功能化納米粒（Tf-NP），利用共載兩藥的Tf-NP處理膠質瘤荷瘤小鼠后，DNA損傷標志物和細胞凋亡標志物增加，小鼠存活率顯著高于單獨給藥組。I-BET762與吉西他濱聯用在胰腺癌荷瘤小鼠中顯著降低了腫瘤體積和質量，表現出比單藥更好的效果［39］。IBET762誘導胰腺癌細胞G0/G1期細胞周期阻滯，抑制轉移干細胞因子，上調與化療耐藥相關的唯BH3蛋白Bim的表達，可協同吉西他濱發揮細胞殺傷作用，同時延緩耐藥。Wang等［40］制備了共載紫草素和JQ1的乳鐵蛋白仿生納米粒（Man-LFNPs），紫草素誘導ICD效應，JQ1下調PD-L1的表達，二者協同激活免疫系統，提高抗腫瘤能力。在以CT26荷瘤小鼠為模型的體內抑瘤實驗中，Man-LF NPs組抑瘤率為84%，兩游離藥混合組和紫草素單藥組分別為61%和45%，說明共載兩藥的Man-LF NPs比兩藥單獨使用有更好的抗腫瘤效果。

Figure 5 Mechanism of combination therapy with BRD4 inhibitors

3.2 BRD4抑制與光熱治療

近紅外光照射后，光熱劑產生的熱可殺傷腫瘤細胞，還能產生ICD效應，激活腫瘤免疫。BRD4抑制聯合光熱治療，可以強化機體免疫應答，協同消滅腫瘤細胞。Wang等［41］將JQ1和吲哚菁綠共載于自體腫瘤細胞并以水凝膠包封，獲得疫苗PVAX，用于術后腫瘤治療。在808 nm近紅外光照射下，4T1荷瘤小鼠體內的吲哚菁綠產熱破壞腫瘤細胞，觸發腫瘤抗原釋放，激活機體抗原遞呈與免疫治療；同時PVAX釋放JQ1，下調PD-L1表達，增強CD8+T細胞活性，增強免疫治療效果。另有研究發現，負載JQ1的聚多巴胺納米粒（PDMN-JQ1）對治療PD-L1抗體反應有限三陰性乳腺癌具有積極意義［42］。JQ1抑制BRD4-c-Myc軸，下調PD-L1的表達，載體聚多巴胺可發揮光熱治療作用。用藥物處理4T1荷瘤小鼠后，PDMN-JQ1組的抑瘤效果明顯優于游離的JQ1組（P=0.02）和單獨的PD?MNs組（P=0.02）。PDMN-JQ1同時發揮了c-Myc靶向治療、光熱治療和免疫治療的作用，這種治療策略具有推廣到其他實體瘤治療的潛力。

3.3 BRD4抑制與免疫治療

BRD4抑制可下調PD-L1的表達，解除腫瘤細胞的免疫抑制，與免疫檢查點阻斷劑聯合，具有巨大的潛力和臨床應用價值。將JQ1與CTLA-4單抗聯合使用能有效治療前列腺癌［43］。JQ1阻斷CD274編碼的PD-L1表達，增加腫瘤MHC-I的遞呈，增強CD8+T細胞作用，與CTLA-4單抗聯合使用對DU145和PC3異種移植小鼠的抑瘤效果更好，延長了荷瘤小鼠生存期。Hogg等［44］將JQ1和PD-1單抗聯合用于淋巴瘤荷瘤小鼠，與單獨用藥組相比，聯合用藥組可顯著延長小鼠生存期，表明聯合治療可協同激活免疫。

3.4 BRD4抑制與分子靶向藥物

多項研究表明，BRD4抑制劑與聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）抑制劑、共濟失調毛細血管擴張突變基因Rad3相關 激 酶（ataxia telangiectasia and Rad3-related，ATR）抑制劑、細胞周期蛋白依賴性激酶2（cyclindependent kinases 2，CDK2）抑制劑等分子靶向藥物聯合使用，可增強抗腫瘤效果。Fehling等［45］研究了BRD4抑制劑JQ1或I-BET762與PARP抑制劑奧拉帕尼或維利帕尼聯用對于膽管癌細胞系的影響，發現JQ1使c-Myc及其下游靶點Chk1的表達下降，DNA損傷標志物γH2AX增加，而PARP抑制劑抑制DNA損傷修復，聯合使用產生協同毒性作用。體內抑瘤實驗表明，JQ1和奧拉帕尼同時使用可顯著抑制KKU-055膽管癌荷瘤小鼠腫瘤的生長。BRD4抑制劑RVX2135可增強細胞對ATR抑制劑AZ20的敏感性，二者聯合使用可加劇DNA損傷，協同誘導淋巴瘤細胞死亡，抑制荷瘤小鼠腫瘤的生長［46］。CDK2抑制劑Milciclib和JQ1聯用可共同抑制c-Myc的表達，引起細胞周期阻滯和細胞凋亡，聯合治療顯著延長了髓母細胞瘤GTML2同種異體移植小鼠的生存期［47］。

4 耐藥性

抑制BRD4的策略雖然具有確切的抗腫瘤作用，但是在白血病、前列腺癌、乳腺癌等多種腫瘤中顯示出一定的耐藥性。主要表現為對c-Myc等腫瘤相關基因抑制效率降低、誘導腫瘤細胞凋亡能力不強和抗增殖活性低下等［4］。耐藥機制之一是腫瘤細胞相關基因轉錄的恢復。Rathert等［48］發現，持續使用JQ1可通過Wnt信號通路代償性上調c-Myc，使治療效果下降。在三陰性乳腺癌中，蛋白磷酸酶2A下調而導致的BRD4過磷酸化可恢復BCL2L1/BCL-XL基因轉錄，產生對BRD4抑制劑的耐藥現象［49］。另外，腫瘤細胞BRD4的積累也可產生耐藥性。例如，核受體輔阻遏物2-組蛋白去乙酰化酶10-去泛素化酶3-溴結構域蛋白4（nuclear receptor corepressor 2-histone deacetylase 10-deubiq?uitylating enzyme 3-bromodomain-containing protein 4，NCOR2-HDAC10-DUB3-BRD4）信 號 通 路 中NCOR2-HDAC10復合物的破壞會引起BRD4上調［50］。一些腫瘤中，NCOR2基因缺失或突變使去泛素化酶DUB3過度表達，拮抗E3-泛素連接酶介導的BRD4的泛素化降解，使BRD4水平升高。斑點型鋅指結構蛋白/BRD4信號軸的阻斷也會引起BRD4無法通過泛素化降解而上調，抵抗以BRD4為靶點的治療手段誘導的細胞生長停滯和凋亡［51］。

5 總結展望

本文介紹了BRD4的結構及其在腫瘤中的作用，綜述了BRD4的抑制策略、在腫瘤聯合治療中應用以及耐藥性的研究進展。BRD4抑制劑和降解劑可強效抑制BRD4，進而抑制腫瘤細胞增殖，促進免疫殺傷，具有良好的抗腫瘤活性。目前，OTX015、CPI-0610、AZD5153等多種BRD4抑制劑已經進入臨床研究階段；將BRD4抑制與化學治療、光熱治療、免疫治療等聯合用于腫瘤治療，可產生協同抗腫瘤作用，極具臨床應用前景。

雖然BRD4的抑制策略已取得很多進展，但仍有一些問題需要解決：一是臨床試驗中患者具有輕中度的不良反應，可進一步進行結構改造或開發安全性更好的BRD4抑制劑；二是積極開發二價型BRD4抑制劑和新型BRD4降解劑，提高抗腫瘤活性；三是持續用藥產生耐藥性，應深入研究其耐藥機制并找尋降低耐藥性的方法；再者，結合納米藥物遞送系統，實現體內靶向遞送，提高治療效果。相信在不久的將來，靶向BRD4的治療策略會在臨床腫瘤治療中發揮更大的作用。