基于腫瘤相關巨噬細胞靶向調控的抗腫瘤策略

褚旭新，卜凡雪，殷婷婕，霍美蓉

（中國藥科大學藥學院藥劑系，南京210009）

腫瘤的發展是一個復雜的多步驟過程，包括轉化、增殖、血管生成、免疫調節和轉移［1］。然而，腫瘤的發生與發展不僅由腫瘤細胞本身積累的遺傳突變誘導，還受到周圍非惡性細胞的強烈影響［2］。腫瘤微環境（tumor microenvironment，TME）中細胞釋放的不同類型的生長因子和細胞因子以及細胞間的信號通路在腫瘤發生和轉移中起十分重要的作用［3］。腫瘤微環境包括許多常駐細胞類型，例如巨噬細胞、成纖維細胞、淋巴細胞、內皮細胞和周細胞等（如圖1所示），它們可通過直接或間接的作用影響彼此的功能或表型，并促進腫瘤細胞的生長［4］。

Figure 1 Cellular constituents of thetumor microenvironment[17]

腫瘤相關巨噬細胞（tumor-associated macro?phages，TAMs）是TME中最豐富的固有免疫細胞種群，占腫瘤質量的50%［5-6］。巨噬細胞是單核吞噬細胞系統（mononuclear phagocytic system，MPS）的一部分，由骨髓來源的外周血單核細胞前體在局部募集并響應趨化因子和生長因子分化形成［7］。巨噬細胞極具可塑性，可以根據環境刺激獲得不同的功能表型。按照M1/M2命名法巨噬細胞可被定義為兩種極化表型：當受到toll樣受體（toll-like receptor，TLR）激動劑、微生物底物［如脂多糖（lipo?polysaccharide，LPS）］和輔助型T細胞1（Thelper 1 cell，Th1）因子［如干擾素（interferonγ，IFN-γ）］適當刺激時，經典激活為免疫增強型——M1型，具有引起炎癥反應，增強抗腫瘤免疫的能力［8］；在腫瘤部位被各種輔助型T細胞2（Thelper 2 cell，Th2）因子［如白介素-4（IL-4）和白介素-13（IL-13）］刺激時，替代激活為免疫抑制型——M2型，發揮抗炎作用，促進腫瘤生長和轉移［9］。

腫瘤微環境以缺氧、弱酸性為主要特征，通常不存在誘導M1型巨噬細胞極化的細菌刺激物、Th1細胞因子及代謝環境，且普遍存在Th2細胞因子，因此TAMs在腫瘤部位多呈現M2表型［10］。M2-TAMs表現出多項促腫瘤作用：（1）抑制腫瘤免疫反應，特別是T細胞介導的細胞毒性［11］；（2）誘導腫瘤血管生成［12］；（3）參與腫瘤遷移，侵襲和轉移［13］；（4）增強腫瘤化學療法和放射療法的耐藥性［14］。綜上，作為TME中主要的免疫細胞，TAMs在腫瘤發展和轉移的各個階段均起關鍵作用［15］。因此靶向調控TAMs的策略成為一種多機制、多功能的高效療法，可激活抗腫瘤免疫反應、抑制腫瘤生長、血管生成和轉移擴散；并改善化療耐藥和不良預后。同時，與化療等經典療法相比，TAMs調控策略是通過調節自身免疫系統功能對抗腫瘤，對患者正常組織的損傷較小。鑒于TAMs已成為抗腫瘤治療的新靶標，臨床前研究揭示了越來越多的關鍵途徑以調節TAMs功能。目前，針對TAMs的新型調控策略在腫瘤免疫治療以及與其他療法的聯合治療均表現出巨大的潛力［16］。

1 TAMs靶向調控策略

基于TAMs在腫瘤發生發展中的功能，TAMs靶向調控策略包括：TAMs耗竭、抑制TAMs募集和TAMs復極化［18］。

1.1 TAMs耗竭

TAMs調控的策略之一是使用消耗巨噬細胞的化學試劑直接清除TAMs，降低TAMs在腫瘤組織的密度，從而逆轉免疫抑制型腫瘤微環境［19］。

集落刺激因子1（colony-stimulating factor 1，CSF1）是大多數巨噬細胞種群的主要調節劑和趨化因子，其受體CSF1R是一種酪氨酸激酶，可促進單核細胞和巨噬細胞的存活、增殖和分化［20］。巨噬細胞對CSF1/CSF1R信號轉導的依賴使CSF1R成為選擇性耗盡TAMs的靶標。目前，針對CSF1R信號的不同抗體和小分子已被廣泛研究。它們單獨或聯合用于耗竭TAMs，重塑TME，進而發揮抗腫瘤作用［21］。Ries等［22］研制了抑制CSF1R活化的單克隆抗體（RG7155）。體外實驗結果表明，RG7155可誘導巨噬細胞凋亡；在動物模型中，RG7155可顯著降低F4/80+TAMs的密度，并伴隨CD8+/CD4+T細胞比例的增加，改善免疫抑制型腫瘤微環境，激活抗腫瘤免疫；對于腫瘤患者，RG7155可使腫瘤組織中CSF1R+CD163+TAMs顯著減少，臨床抗腫瘤效果優異。

另一種TAMs消耗策略是基于雙膦酸鹽（bisphosphonates）的應用。鑒于對羥基磷灰石的高結合親和力，雙膦酸鹽一般被用于抑制破骨細胞的功能，抑制骨吸收，從而治療骨質疏松癥、骨轉移和骨科Paget's病［23］。而近年來研究發現，雙膦酸鹽（氯膦酸鹽、唑來膦酸鹽等）可影響TAMs的增殖并誘導其凋亡，減少新血管生成，最終抑制腫瘤生長和轉移［24-25］。但其抗腫瘤活性常常受到血漿半衰期短和脫靶效應的限制［26］。因此，為了改善雙膦酸鹽的藥代動力學，減少不良反應（例如下頜骨壞死），并促成骨骼以外的生物分布以適應非骨骼相關治療領域的應用，研究者們通常使用雙膦酸酯脂質體制劑或納米顆粒靶向消耗TAMs［27］。如Zang等［28］開發的脂質包覆的唑來膦酸鈣納米粒（CaZol@pMNPs）能特異性靶向TAMs并誘導其凋亡。在S180荷瘤小鼠模型中，CaZol@pMNPs有效地消耗了TAMs，顯著減少了血管生成，削弱了免疫抑制作用，并最終抑制了腫瘤的生長。

1.2 抑制TAMs募集

單核細胞/巨噬細胞從血液中募集并滲入腫瘤。因此，通過靶向和影響單核細胞來破壞TAMs的產生，可有效抑制TAMs募集，減少實體瘤中的TAMs浸潤，重塑免疫抑制TME［29］。

單核細胞和單核細胞型骨髓來源的抑制性細胞（monocyte-related myeloid-derived suppressor cells，M-MDSCs）是TAMs的前體，在多種化學引誘劑的指導下募集到腫瘤部位。常見的誘導劑包括趨化因子（如CCL2，CCL5）和細胞因子（如VEGF家族成員）［30］。利用小分子抑制劑或特異性抗體阻斷相關信號通路是抑制TAMs募集的有效手段。例如，在晚期胰腺癌模型中，腫瘤細胞釋放的CC族趨化因子配體2［chemokine（C-C motif）ligand 2，CCL2］募集表達相關受體（CCR2）的經典單核細胞至腫瘤部位，可導致腫瘤組織中TAMs數量積累和不良預后。CCR2抑制劑PF-04136309可有效阻斷CCL2-CCR2軸通路，其與FOLFIRINOX（亞葉酸鈣+氟尿嘧啶+伊立替康+奧沙利鉑）化療的聯合療法使腫瘤內CCR2+單核細胞數量減少，且較單一化療表現出更明顯的局部腫瘤控制效果［31］。

1.3 TAMs復極化

盡管TAMs主要表現為促腫瘤表型，但巨噬細胞作為重要的吞噬細胞，同時具有抗原提呈能力。在腫瘤發展的不同階段以及治療過程中，TAMs具有從腫瘤促進型轉換為腫瘤殺傷型的能力，并通過激活免疫反應抑制腫瘤的生長［32］，其復極化過程如圖2所示。這表明利用巨噬細胞可塑性誘導TAMs復極化為抗腫瘤表型是一種可行的靶向治療策略。細胞因子、趨化因子、生長因子與其受體的相互作用可指導TAMs極化程序［33］，因此，借助小分子，抗體和RNA重塑TAMs表型是一種常用的免疫調節策略，可以單獨或與其他策略（如經典化療、免疫檢查點抑制劑療法等）聯合用于抗腫瘤治療。

Figure 2 Illustration of TAMs repolarization[34]

一種手段是通過阻斷CD47/SIRPα（“別吃我”）信號，增強TAMs的吞噬特性，恢復對腫瘤細胞的清除機制［35］。如抗CD47單克隆抗體（Hu5F9-G4、CC-90002等）或可溶性重組融合蛋白SIRPα-Fc（TTI-621）對該信號通路的藥理抑制作用可有效增強TAMs對腫瘤細胞的吞噬能力。此外，此策略與其他抗體（如利妥昔單抗等）聯合用于治療淋巴瘤，可進一步增強腫瘤抑制效果［36］。

Toll樣受體（TLR）是一種模式識別受體（pat?tern recognition receptor，PRR），在先天免疫應答的激活中具有重要作用。細菌顆粒（如LPS）或病毒核酸（RNA或DNA）對TLR的激活能夠誘導免疫反應，使巨噬細胞趨向于促炎的M1表型。不同的TLR激動劑可模擬微生物信號，將TAMs轉換為殺傷腫瘤的表型［37］。如TLR3激動劑聚肌胞苷酸［Poly（I∶C）］作為一種抗腫瘤疫苗，可使黑色素瘤中的TAMs重新極化，從而改善晚期癌癥的抗腫瘤免疫反應［38］。膠原結構巨噬細胞受體（macro?phage receptor with collagenous structure，MARCO）是屬于清道夫受體家族的PRR。MARCO主要由巨噬細胞表達，其表達與多種腫瘤的不良預后有關。據報道，針對MARCO受體的抗體可將TAMs再極化至促炎表型，與檢查點細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4（cytotoxic T-lymphocyte-associated pro?tein 4，CTLA-4）抑制劑聯用可提高抗腫瘤免疫應答［39］。

此外，與巨噬細胞表型極化相關的信號通路中的關鍵激酶也可作為調節的靶點，幾種小分子抑制劑通過調節巨噬細胞的重新極化發揮抗腫瘤作 用。例 如，PI-3激 酶γ（PI-3 kinase gamma，PI3Kγ）是介導TAMs免疫抑制作用的關鍵調節劑，其抑制劑通過誘導M1-TAMs產生炎癥反應，阻止腫瘤生長［40］。

另一個有潛力的策略是在表觀遺傳水平上誘導TAMs復極化。如組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）抑制劑TMP195能夠改變TAMs表觀遺傳學特征，從而使其趨向于M1行為，誘導它們在乳腺癌TME中積累，并增強其吞噬活性［41］。

除此之外，一些無機納米粒如氧化鐵納米粒、碳酸鈣納米粒等，可通過調節活性氧、腫瘤微環境的酸度等介導TAM的復極化［42］。

相比于TAMs耗竭和抑制TAMs募集策略，TAMs復極化策略不僅使免疫抑制型TAMs減少，還使促炎表型巨噬細胞增加，更高效地逆轉了免疫抑制型TME。同時，該策略避免了巨噬細胞急劇減少對正常組織的影響，不良反應較小。因此，TAMs復極化策略在腫瘤免疫治療領域受到更廣泛的關注。

2 納米載體靶向TAMs治療策略

許多針對不同分子靶標的藥物具有調節TAMs進而對抗腫瘤的潛力。下一個挑戰是如何將這些免疫調節藥物有效地、選擇性地傳遞給TAMs，最大限度地降低脫靶問題和藥物不良反應。著眼于納米遞藥技術的最新進展，納米材料介導的TAMs靶向策略，可特異性增強抗腫瘤免疫反應，已展現出明顯的臨床前療效和潛在的臨床意義。目前，靶向TAMs納米載體的設計主要依賴于腫瘤血管的高通透性和高滯留（enhanced perme?ability and retention，EPR）效應以及受體與配體或抗原與抗體間的相互識別作用，分別稱為“被動靶向”和“主動靶向”策略［43］，其靶向過程如圖3所示。

Figure 3 Current targeting strategies for cancer therapy

2.1 被動靶向至TAMs

作為生物體內清除細胞碎片、病原體和異物的主要細胞，巨噬細胞具有很高的吞噬能力。對于納米載藥系統，巨噬細胞可以不加選擇地使其內在化，且通常M2-TAMs比M1-TAMs表現出更高的納米粒內化效率。另外，TAMs是TME中最豐富的細胞種群，靶向腫瘤部位的納米粒通過非特異性脫靶效應，可以被TAMs攝取。如雙膦酸鹽脂質體依賴在腫瘤部位的被動積累，誘導動物體內TAMs的凋亡，是目前耗竭TAMs的主要納米制劑［45］。

基于EPR效應和巨噬細胞自身的吞噬能力，納米載藥系統可以被動靶向至TAMs，并對其進行特異性調控，從而改善免疫抑制型腫瘤微環境，最終發揮抗腫瘤作用。然而，仍有大部分納米粒在TME中被腫瘤細胞或其他非惡性細胞內吞，從而降低其在TAMs中的富集水平，削弱了調控效果。因此，基于TAMs高表達的表面受體，設計特異性配體修飾型的納米載體用于主動靶向TAMs，可有效提高內吞和調控效率［46］。

2.2 巨噬細胞主動靶向策略

2.2.1 甘露糖受體介導的主動靶向 甘露糖受體（CD206）由于在巨噬細胞上過表達而成為最常用的TAMs靶向受體之一［47］。天然配體甘露糖結構簡單，可輕松地與載體結合，發揮靶頭作用。Zang等［48］報道了基于甘露糖修飾的磷酸鈣納米粒（CaP/miR@pMNPs）用于TAMs靶向治療。該納米粒在生理pH（pH 7.4）下被脂質包覆屏蔽，被MPS中的正常巨噬細胞攝取較少；在TME中（約pH 6.8），對弱酸敏感的脂質屏蔽層響應性脫落，并暴露出甘露糖靶頭以促進TAMs攝取。該載體用于遞送具有促炎作用的miR155，可重塑TAMs并激活其功能，逆轉免疫抑制性TME，并在荷瘤小鼠模型中抑制腫瘤生長。然而，由于甘露糖與載體結合率較低，甘露糖受體介導的主動靶向策略依然存在脫靶風險。因此，作為甘露糖的替代物，CD206抗體被用于靶向TAMs，從而提高納米載體的靶向效率［49］。

2.2.2 葉酸受體β介導的主動靶向 葉酸受體β（folate receptorβ，FRβ）也是巨噬細胞高表達的表面受體，其與葉酸具有納摩爾級別的高度親和力。因此，可使用其配體葉酸修飾納米粒介導TAMs靶向遞送［50］。Hattori等［51］評估了載唑來膦酸的葉酸偶聯型脂質體（FL-ZOL）的靶向能力，發現FL-ZOL對鼠源巨噬細胞RAW 264.7表現出高細胞毒性，而對FRβ陰性的小鼠結腸腺癌細胞CT26則無毒性，表明FL-ZOL可通過FRβ介導的內吞作用選擇性地被TAMs內化。因此，構建葉酸偶聯型載藥系統是解決TAMs靶向問題的可行思路。

2.2.3 豆莢蛋白和轉鐵蛋白受體介導的主動靶向 豆莢蛋白（legumain）和轉鐵蛋白受體（trans?ferrin receptor）是在巨噬細胞過表達的另外兩個靶標受體，且廣泛存在于幾種腫瘤細胞類型中［52］。

基于豆莢蛋白對Ala-Ala-Asn底物序列的蛋白水解活性，可設計靶向TAMs前藥或智能藥物遞送系統［53］。Lin等［54］通過將含有上述序列的底物肽偶聯在阿霉素上，設計了一種豆莢蛋白激活型的阿霉素前藥Leg-3。Leg-3在TME中被選擇性激活，從而有效清除TAMs，并導致腫瘤血管的生成顯著減少。體內實驗證實，施用Leg-3后，鼠腫瘤模型中腫瘤的生長和轉移受到明顯的抑制。這些結果表明，豆莢蛋白的TAMs靶向可能代表了一種新的抗腫瘤策略。

盡管TAMs高表達的轉鐵蛋白受體受到廣泛關注，且研究者們已經報道了許多靶向轉鐵蛋白受體的藥物遞送系統。但所有這些系統都是針對靶向表達該受體的腫瘤細胞而設計的，尚未見對TAMs具體應用的報道［55］。

2.3 M2-TAMs特異性主動靶向策略

甘露糖受體、葉酸受體β以及豆莢蛋白除了在M2-TAMs表面高表達之外，在TME中其他細胞（如樹突狀細胞、M1-TAMs和腫瘤細胞等）也有表達［56-57］，造成載藥納米遞送系統的脫靶效應。因此，研究者們通過肽篩選技術開發了一種特異性靶向M2-TAMs的多肽（M2pep）。該肽對M2-TAMs的結合能力高于M1-TAMs以及其他細胞，可更高效地介導M2-TAMs主動靶向［58］。Pang等［59］設計了M2pep包覆的PLGA納米粒遞送CSF1-CSF1R通路抑制劑（PLX3397）用于治療B16F10腫瘤。無論在體內還是體外實驗中，相比于游離藥物和無M2pep納米粒，M2pep修飾的納米粒都表現出更高效的TAMs攝取。這些結果表明，M2pep包裹可以增強納米粒與M2-TAMs相互作用，促進藥物的遞送。

3 納米遞送系統同時靶向TAMs和腫瘤細胞治療策略

在臨床上，針對腫瘤細胞本身的治療仍然是腫瘤藥物治療領域的主要手段。然而，單獨靶向惡性細胞的療法不僅效果不理想，還常常引起腫瘤對單一藥物的耐藥性。因此，針對腫瘤細胞和微環境中的主導免疫細胞（TAMs）的聯合治療策略備受關注。該策略具有以下優點［60-61］：（1）逆轉免疫抑制型腫瘤微環境，削弱微環境介導的耐藥性；（2）通過調節患者自身免疫對抗腫瘤，不良反應更低且藥效更持久；（3）免疫療法與腫瘤細胞靶向治療的結合產生抗腫瘤協同藥效。然而，分別多次施用針對兩種細胞的不同藥物常常引起治療效果不同步、藥物間相互干擾以及治療依從性差等問題。利用納米載體遞送同種藥物至腫瘤細胞和TAMs，不僅克服了多次給藥帶來的諸多困難，還可實現對兩種細胞的同時靶向調控，達到更理想的聯合治療效果。

Chen等［62］根據葉酸受體在腫瘤細胞和TAMs表面的過表達，制備了基于葉酸偶聯型羧甲基殼聚糖的雙靶向siRNA遞送系統，用于同時沉默TAMs和Lewis肺癌細胞（LLC）中具有細胞惡性轉化作用的信號傳導及轉錄激活蛋白3（signal trans?ducer and activator of transcription 3，STAT3）。實驗結果表明，與非靶向納米粒相比，雙重靶向遞送系統表現出更高的效力，致使兩種細胞中STAT3的表達顯著降低，從而成功實現TAMs向M1型的轉變以及LLC的凋亡；同時，在體內實驗中，腫瘤的生長被有效抑制，腫瘤組織中的M2-TAMs水平顯著降低。Conde等［63］設計了一種基于M2pep的金納米粒（AuNPs）用于siRNA的遞送。在體內主動靶向TAMs，被動靶向肺癌細胞，從而在兩種細胞中同時抑制血管內皮生長因子（vascular endotheli?al growth factor，VEGF）通路，引起TAMs減少和腫瘤細胞增殖抑制，其作用機制如圖4所示。這種混合治療方法表現出理想的雙重基因敲除效果，且免疫記憶的產生可引起長效的腫瘤抑制和疾病控制，是一種高效的抗腫瘤免疫療法。

4 總結與展望

TAMs是TME中最豐富的免疫細胞種群，由于與腫瘤生長、轉移擴散和治療失敗密切相關，成為腫瘤免疫治療的熱門靶標。抑制TAMs募集、耗竭TAMs和使TAMs復極化3種策略均具有調控TAMs從而逆轉免疫抑制性TME的可行性。同時，主/被動靶向型納米載體的應用，進一步優化了TAMs靶向調控策略。然而，據報道，納米粒到達腫瘤部位后，常常脫靶至TME中豐富的腫瘤細胞，使單獨靶向TAMs的療法不能達到理想的抗腫瘤效果［64-65］。因此，合理選擇TAMs和腫瘤細胞中共同的靶點，并通過納米載藥技術同時靶向調控TME中兩種重要細胞的治療策略，已逐漸成為納米制劑學與腫瘤免疫治療相結合的新熱點。

Figure4 Schematic of the combined silencing therapy in vivo viananoparticles targeting TAMs and cancer cells[63]

此外，TME中還存在多種其他免疫細胞，它們對于腫瘤增殖和轉移同樣起到關鍵作用。在未來的研究中，將M2-TAMs與其他免疫細胞（如T細胞、NK細胞等）的調控藥物共載于納米遞送系統中，有望更高效地改善TME；與此同時，對納米載體進行更多功能化修飾，改善藥物的循環穩定性和生物分布，并實現可控的藥物釋放，將成為TME靶向調控策略的下一個研究方向。