水禽H6N6亞型禽流感病毒在豬和人的肺組織中的復制能力的體外研究▲

林裕貴 龐夏鳳 李程頤 孫增輝 朱銀川 王熹婧 林春秀 張增峰

(1 廣西醫科大學微生物學教研室，南寧市 530021，電子郵箱：18324180870@163.com；2 江南大學食品學院，江蘇省無錫市 214122)

研究表明，H6N6亞型禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)已經在歐亞地區的野禽和家禽中廣泛流行，其感染宿主的范圍不斷擴大，從主要感染水禽逐漸進化為感染陸禽、哺乳動物，甚至具有感染人類的潛能[1]。前期研究結果顯示，陸禽H6N6亞型AIV已經具備感染哺乳動物豬及人類的潛能[2-3]。水禽鴨、鵝在流感病毒生態系統中起非常重要的作用，然而水禽H6N6亞型AIV是否具有感染哺乳動物豬及人類的潛能，目前仍未完全清楚。本研究將前期分離出的2株水禽流感病毒鴨H6N6亞型AIV A/DK/GX/750/2010(簡稱GX750)、鵝H6N6亞型AIV A/GS/GX/399/2010(簡稱GX399)，進行基因測序和遺傳進化分析，以了解其基因來源和基因特點，然后通過體外感染豬肺和人肺組織來檢測病毒的復制能力和組織病理改變，旨在探討水禽H6N6亞型AIV感染哺乳動物豬及人類的潛能及其跨物種傳播風險，為H6N6亞型AIV的監測和防控提供依據。

1 材料和方法

1.1 實驗毒株及組織標本 兩株H6N6亞型AIV GX750、GX399分離于2010年廣西南寧市活禽交易市場；選擇先前已證實能在豬和人肺組織有效地復制的H9N2亞型AIVA/DK/GX/767/2010(簡稱GX767)作為陽性對照病毒株。將病毒接種于10日齡的無特定病原體級雞胚(廣西富鳳農牧集團有限公司)進行擴增，采用血凝試驗和半數組織培養感染試驗(50%tissue culture infective dose,TCID50)分別檢測病毒滴度和感染力(見表1)。新鮮豬肺組織取自4～5月齡的無特定病原體級巴馬香豬(廣西大學動物遺傳育種與繁殖研究所)，新鮮人肺組織取自廣西醫科大學第一附屬醫院肺組織切除手術標本，所需組織標本均獲廣西醫科大學實驗動物倫理委員會和廣西醫科大學醫學倫理委員會審批同意，所有實驗均在生物安全二級實驗室中進行。

表1 實驗毒株的基本資料

1.2 主要試劑 MEM培養基、F12-K培養基、胎牛血清、TPCK-胰酶購自Gibco公司(批號：1810992、1854888、1715752、1832635)；鏈-青霉素購自Solarbio公司(批號：20160817)；免疫組化試劑盒、蘇木精染液、伊紅染液、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)、枸櫞酸鹽抗原修復劑購自福州邁新生物技術開發有限公司(批號：1703249720、141201445V、1001036198、17030701、1114AD23)；4%多聚甲醛購自Biosharp公司(批號：1608145)；小鼠源核蛋白抗體購自廈門大學國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術研究中心；TRIzol購自Thermo公司(批號：50175111)；反轉錄試劑PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser、PCR反應試劑PremixEx TaqTMVersion 2.0、DNA Marker試劑100 bp DNA Ladder購自TaKaRa公司(批號：AK2601、A120806A、100-55-2)；DNA膠回收試劑EasyPure? Quick Gel Extraction Kit購自TransGen公司(批號：L41118)；0.6%火雞紅細胞懸液由廣西醫科大學微生物教研室自配。

1.3 實驗方法

1.3.1 病毒基因測序：采用TRIzol法提取病毒RNA，采用國家流感中心提供的甲型流感病毒基因引物，反轉錄合成病毒cDNA；使用PCR反應試劑進行PCR擴增及DNA電泳，DNA膠回收試劑回收電泳膠進行DNA純化，采用Illumina公司Solexa系統進行全基因組測序。所有操作均嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3.2 遺傳進化分析：應用BLAST程序對兩株H6N6亞型AIV的8個基因片段進行比對，應用MEGA 7.0軟件，以GenBank數據庫http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html中的相關流感病毒為參考序列，采用最佳模型和最大似然法(參數設置為1000 replications) 繪制病毒基因的系統進化樹，以進行遺傳進化分析。

1.3.3 病毒體外感染肺組織：采集新鮮豬肺和人肺組織標本，用F-12K培養基反復沖洗，然后切除可疑病變組織，將剩余正常組織切成數塊，每塊體積約0.2 cm×0.2 cm×0.2 cm。體外感染前每種標本隨機留取兩塊組織，分別行流感病毒核蛋白檢測和病毒分離培養，以明確本實驗所選取的組織無流感病毒感染。每種標本隨機選擇6塊組織分別置于4個6 mm培養皿中(3個感染組和1個空白組)，每1個感染組的培養皿接種1株病毒，分別加入2 mL含TCID50為106/mL的病毒的F-12K培養基，37℃、5% CO2吸附2 h，同時用F-12K培養基代替病毒液作為空白對照組。吸附完成后組織經PBS反復沖洗3次后置于6孔板中，每孔放入2塊組織，用1 mL含0.2%TPCK-胰酶和1%鏈-青霉素的F-12K培養基37℃、5%CO2繼續培養，分別在接種后24 h、48 h、72 h隨機收獲一孔中的組織和培養上清液。其中，1塊組織加入4%多聚甲醛浸泡固定24 h，另1塊組織經PBS反復沖洗3次后研磨為組織勻漿液。組織研磨液和培養上清液分別接種于10 d雞胚進行病毒培養，然后行血凝試驗檢測病毒滴度。

1.3.4 觀察組織病理改變：組織經4%多聚甲醛固定、脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟，蘇木精染液染色2 min、鹽酸酒精脫色、自來水返藍、伊紅染液染色3 min、梯度酒精脫水，光學顯微鏡下觀察、拍照。

1.3.5 免疫組化檢測病毒核蛋白的表達：組織經4%多聚甲醛固定、脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟，經3% H2O2溶液阻斷內源性過氧化物酶，檸檬酸鈉緩沖液高溫高壓修復抗原，山羊血清封閉非特異性位點結合位點，滴加一抗核蛋白抗體(1 ∶2 000)4℃過夜孵育，滴加生物素標記山羊抗兔/鼠IgG二抗，滴加鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化物酶，二氨基聯苯胺顯色、蘇木素復染。用PBS代替一抗作陰性對照。陽性結果為鏡下呈棕黃色，主要位于細胞核，少量存在于核周細胞質。

2 結 果

2.1 基因測序和遺傳進化分析結果 目前，H6亞型AIV可分為歐亞譜系和北美譜系，歐亞譜系可進一步分為Ⅰ組(ST339-like)、Ⅱ組(ST2853-like)、Ⅲ組(HN573-like)3個主要分支[4]。遺傳進化分析結果表明，兩株H6N6亞型 AIV GX750、GX399為同一重配病毒的不同變型，8個基因片段均來源于歐亞譜系的水禽源進化分支，HA基因屬于Group-Ⅱ(ST2853-like)主要分支中的A/duck/Guangxi/GXd-6/2010(H6N8)分支(圖1)，NA基因屬于A/duck/Guangxi/GXd-4/2009(H6N6)分支(圖2)；其余內部基因中，PA基因屬于A/duck/Guangxi/052/2010(H6N5)分支，NP、NS基因屬于A/duck/Guangxi/058/2010(H6N6)分支，M基因屬于A/duck/Guangxi/GXd-6/2010(H6N8)分支，PB1基因屬于A/duck/Guangdong/S1663/2009(H6N6)分支，PB2基因屬于A/duck/Henan/S4179/2009(H4N6)分支。

圖1 AIV GX750和AIV GX399 的HA基因進化樹

圖2 GX750和GX399 的NA基因進化樹

2.2 體外感染豬肺和人肺組織后病毒分離培養結果 病毒感染前采集的新鮮豬肺和人肺組織均未分離、檢測出流感病毒，表明本實驗所采集的新鮮豬肺和人肺組織均未被流感病毒感染。兩株H6N6亞型AIV GX750、GX399體外感染豬肺和人肺組織后將組織勻漿及培養上清液接種于10 d雞胚，收獲尿囊液，采用血凝試驗檢測病毒滴度。結果顯示，水禽兩株H6N6亞型AIV體外接種豬和人的肺組織后24 h、48 h、72 h，病毒分離培養均呈陽性(見表2)，表明兩株水禽源性H6N6亞型AIV可在哺乳動物豬和人的肺組織有效地復制。

表2 兩株水禽H6N6亞型AIV接種豬肺和人肺組織后在雞胚分離培養的病毒滴度

2.3 體外感染豬肺和人肺組織后肺組織病理變化和流感病毒核蛋白組織嗜性 蘇木精-伊紅染色結果顯示，3個時間點均可見豬肺組織和人肺組織感染病毒后呈現出不同程度的病理改變，豬肺組織表現為肺泡腔內少量肺泡細胞壞死脫落，人肺組織則表現為肺泡結構破壞和較多肺泡細胞壞死脫落以及炎癥細胞浸潤。H6N6亞型AIV GX750、GX399體外感染豬肺組織后，兩株病毒在豬肺組織內均出現核蛋白表達，主要表達部位為肺泡細胞和肺泡巨噬細胞；H6N6亞型AIV GX750、GX399體外感染人肺組織后，兩株病毒在人肺組織同樣出現核蛋白表達，主要表達部位為肺泡細胞和肺泡巨噬細胞(圖3)。

圖3 兩株H6N6亞型AIV體外接種豬肺和人肺組織后的核蛋白免疫組化檢測結果

3 討 論

H6亞型AIV最初主要流行于野生水禽，隨后逐漸蔓延至鵝、家鴨、雞、鵪鶉等家禽，隨后在我國豬群中分離出了H6N6亞型流感病毒[5]。目前，在我國家禽中主要流行H6N2和H6N6，而H6N6已逐漸取代H6N2成為H6優勢亞型[6]。值得注意的是，2013年中國臺灣地區發生了首例人感染H6N1亞型AIV病例，表明H6亞型AIV可以實現跨種間屏障直接感染人類，其對人類健康和公共衛生安全的潛在威脅不容忽視[7]。目前認為，禽流感病毒和人流感病毒分別主要與唾液酸SA-α-2,3Gal受體和SA-α-2,6Gal受體結合而感染對應的宿主細胞，其中SA-α-2,3Gal受體主要分布在人下呼吸道組織的肺泡、細支氣管及終末細支氣管，而SA-α-2,6Gal受體則主要分布于上呼吸道組織的氣管、支氣管，這種受體在呼吸道分布的生理結構差異被認為是AIV跨種間屏障感染人類的主要障礙[8]。水禽是流感病毒的天然宿主，從禽類、人類和其他哺乳動物所分離得到的流感病毒幾乎都來源于水禽，因此水禽AIV是不同動物流感病毒的先祖[9]。研究表明，中間宿主豬是AIV突破“禽類-人類”種間傳播障礙的重要宿主，豬的不同呼吸道結構中均同時存在兩種流感病毒唾液酸受體，可同時感染禽流感病毒和人流感病毒，不同來源的流感病毒在豬體內發生重配和適應性突變，使其對人的感染能力增強[10]。此外，陸禽(如雞、鵪鶉等)也可充當AIV進化過程中的中間宿主，全球首例人感染H6N1亞型AIV以及近幾年流行的H7N9、H5N6 亞型AIV的基因均在雞體內發生重配而產生[11-13]。但水禽H6N6亞型AIV是否可以感染哺乳動物豬尚未清楚。本研究選擇的兩株H6N6亞型AIV GX399、GX750分別分離于水禽鵝、鴨，遺傳進化分析表明其內部基因均來源于水禽流感病毒，可作為水禽H6N6亞型AIV的研究毒株。本研究將兩株水禽H6N6亞型AIV體外感染豬肺組織，結果顯示，在感染后不同時間點，豬肺組織勻漿液和培養上清液的病毒分離培養均呈陽性；核蛋白是流感病毒核糖核蛋白的主要成分，參與核內病毒RNA的轉錄和胞質病毒蛋白的翻譯[14]，免疫組化檢測結果提示豬肺組織的病毒核蛋白均呈陽性，陽性細胞主要是肺泡細胞和肺泡巨噬細胞，表明病毒可在豬肺組織中有效地復制，其主要復制部位為肺泡組織；蘇木精-伊紅染色后觀察到豬肺組織出現肺泡細胞壞死及肺泡破壞，表明水禽H6N6亞型AIV感染豬肺部后可以引發肺組織損傷以及炎癥反應，具有一定的致病性。因此，水禽H6N6亞型AIV具有感染哺乳動物豬的潛能，水禽H6N6亞型AIV反復感染豬可以產生適應性突變或與其他亞型病毒基因重配，一旦病毒進化為能與人型SA-α-2,6Gal受體結合，極有可能可以直接感染人類。

為進一步探討水禽H6N6亞型AIV是否具有感染人類的潛能，本研究應用水禽H6N6亞型AIV體外接種人肺組織，結果顯示，人肺組織勻漿、培養上清液的病毒分離培養均為陽性，免疫組化檢測結果顯示肺泡細胞和肺泡巨噬細胞內病毒核蛋白陽性，人肺部組織出現細胞壞死脫落伴有炎癥反應等病理改變，表明水禽H6N6亞型AIV可在人肺組織中有效地復制，提示該類病毒具有感染人的潛能。

綜上所述，在體外，水禽H6N6亞型AIV在哺乳動物豬和人的肺組織中具有較好的復制能力，提示該病毒可以打破傳統的流感進化演變途徑，由水禽源流感病毒直接跨種屬感染哺乳動物，甚至可以直接跨種屬感染人類。因此，必須加強水禽H6N6亞型AIV的監測，密切關注水禽H6N6亞型AIV的流行及進化變異狀況。