復方精油對PM2.5誘導小鼠肺微血管內皮細胞內皮間質轉化的影響

馬柯欣，徐靖斌，任 飛，許 新，劉超生，李發勝*

1大連醫科大學檢驗醫學院，大連 116044；2沈陽市第四人民醫院檢驗科，沈陽 110031

PM2.5(空氣動力學直徑≤2.5 μm的細微顆粒物)是造成空氣污染的主要污染物之一。PM2.5比表面積大，因而很容易附帶有毒有害物質，通過呼吸系統進入到肺泡深部，引發肺部炎癥和損傷并很可能進展為肺纖維化。成纖維細胞的大量增多是肺纖維化的主要表征，膠原蛋白在肺血管外周和肺泡間隔中大量累積，纖維結締組織也隨之增加，最終導致基質硬度增加，氣體交換難度加大。內皮間質轉化(endothelial-mesenchymal transition，EndMT)是成纖維細胞的來源之一，其特征是內皮細胞逐漸失去表型標志物如血管內皮細胞鈣粘連蛋白(vascular endothelial cell cadherin，VE-cadherin/CDH5)和血小板-內皮細胞粘附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule-1，CD31/PECAM-1)，間充質細胞表型標志物表達增強如Ⅰ型膠原蛋白(typeⅠcollagen，Col1)、波形蛋白(vimentin)、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle action，Acta2/α-SMA)和成纖維細胞特異性蛋白1(fibroblast-specific protein 1，Fsp1/S100A4)等。在這個過程中，細胞的增殖能力和遷移能力逐漸增強，最終導致細胞形態發生改變[1,2]。近年來，炎癥誘導EndMT的分子機制已被了解[3]。TGF-β途徑是炎癥誘導EndMT的經典途徑[4]，TGF-β三種異構體均可在多種細胞系中介導EndMT的發生[5]，其中TGF-β1的作用最為明顯。已有研究表明，PM2.5可通過激活TGF-β信號途徑增強肺部炎癥[6]，但其中的具體作用機制以及對肺纖維化的影響尚不清楚。

精油(essential oils，EOs)可通過蒸餾、擠壓或溶劑萃取等方式從芳香植物的花、果實、種子、葉、莖或根中提取，具有抗菌、消炎、抗氧化、抗衰老等多種活性，現已廣泛應用于臨床、藥妝、保健養生等領域[7]。把從芳香植物中提取的精油用作治療醫療目的的“自然療法”稱之為芳香療法，可通過香薰、吸入、外涂或水療等外用藥法給藥。尤加利、薄荷、乳香和云杉精油是治療呼吸系統疾病的常見精油，可以起到溶解黏液、祛痰、殺菌、止咳和鎮痙等作用，進而保護肺部免受炎癥侵害并緩解肺部炎癥[8-10]。我們根據芳香療法將上述四種單方精油復配成復方精油用于本實驗中，探討了復方精油通過TGF-β1/SMAD3/p-SMAD3信號通路對PM2.5誘導的EndMT的干預作用。

1 材料及方法

1.1 復方精油

復方精油由大連醫美芳香療法工作室提供，批號：20170325，由尤加利、云杉、薄荷和乳香單方精油(英國Absolute Aromas公司惠贈、純度近100%)復配而成。復方精油的化學成分分析主要有25種成分，其中桉葉素(16.7%)、α-蒎烯(16.54%)、薄荷醇(12.86%)等[11]。

1.2 試劑

小鼠肺微血管內皮細胞完全培養基和M199培養基(中國普諾賽生命科技有限公司，批號分別為CM-M001、PM150610)；MTT試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、ECL檢測試劑盒(中國凱基生物技術有限公司，批號分別為KGA312、KGP903、KGP1123)；CDH5、TGF-βR1、p-SMAD2和p-SMAD3抗體(中國博奧森生物技術有限公司，批號分別為bs-0878R、bs-0638R、bs-3419R、bs-5616R)；CD31、Col1、Acta2、SMAD2、SMAD3、TGF-β1和S100A4抗體(美國Proteintech公司，批號分別為11265-1-AP、14695-1-AP、14395-1-AP、12570-1-AP、25494-1-AP、21898-1-AP、66489-1-Ig)；PVDF膜(美國Millipore公司，批號為FFP39)；SB431542(美國APExBIO公司，批號為A8249)；RIPA裂解液(中國碧云天公司，批號為P0013B)。

1.3 儀器

酶標儀和PCR儀(美國Bio-Rad公司)；一體化成像儀ImageQuant LAS 500(美國GE醫療公司)；超微量紫外可見分光光度計(美國Thermo公司，型號為SMA4000)；垂直電泳儀和轉膜儀(北京六一生物科技有限公司，型號分別為DYCZ-24DN、DYCZ-40D)。

1.4 PM2.5的提取和懸液制備

1.5 細胞分離培養和分組

小鼠肺微血管內皮細胞(mouse pulmonary vascular endothelial cells,MHC)購自中國普諾賽生命科技有限公司，批號分別為CP-M001，屬于原代細胞。

分離步驟：小鼠經斷頸處死后，75%酒精浸泡5 min，移至超凈工作臺內，仰臥固定小鼠；沿胸部正中線剪開皮膚，打開胸腔，取出肺組織，分離肺葉，放入含雙抗的PBS中；剪下肺葉邊緣1～2 mm處組織，將邊緣組織剪成1 mm3碎塊；PBS清洗組織碎塊1次，用血清潤洗組織碎塊1次，用顯微鑷將組織塊種植于6 cm培養皿中，于37 ℃，5%CO2恒溫培養箱中干貼1 h。

培養步驟：向培養皿中加入2 mL小鼠肺微血管內皮細胞完全培養基，于培養箱內靜置培養，60 h后挑出培養皿內組織塊丟棄，培養皿內更換新鮮培養基，每3天換液1次，細胞長滿后待用。采用小鼠肺微血管內皮細胞完全培養基進行培養，使用第五代到第七代的細胞進行后續實驗。

分組情況：PM2.5組(500 μg/mL)，復方精油組(PM2.5500 μg/mL + CEOs 10-5%)，TGF-β通路抑制劑SB431542組(10 μmol/L)和PM2.5+SB431542組(500 μg/mL + 10 μmol/L)。

1.6 MTT法

采用MTT法測定藥物濃度和細胞活力，酶標儀上檢測各組550 nm的吸光度值，并進行統計學分析。

1.7 細胞劃痕實驗

將1×105個MHC細胞加入6孔組織培養板中；待細胞長滿后，使用無菌的200 μL槍頭尖端在每孔中形成細胞間隙，并用無菌PBS沖洗掉細胞碎片；每孔中按照分組需要加入含不同的受試藥物的新鮮無血清培養基，在規定時間拍照記錄；Image J軟件分析間隙寬度，每組重復3次。

1.8 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)

利用Trizol法提取核酸，按照PrimeScript RT reagent Kit with gDNA eraser操作說明進行反轉錄；按照SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)的要求在冰水浴的條件下進行加樣，離心；使用TP800 PCR擴增儀擴增。采用RT-qPCR方法檢測CDH5、CD31、COL1α1和Acta2的mRNA水平變化(見表1)。

表1 引物序列

1.9 蛋白免疫印跡(Western blot)

各組細胞加入含有PMSF的裂解緩沖液，BCA蛋白檢測試劑盒檢測總蛋白濃度；蛋白質40 μg轉移到0.45 μm的PVDF膜上；5%脫脂牛奶封閉2 h；分別加入CDH5(1∶500)、CD31(1∶1 000)、Col1(1∶2 000)、Acta2(1∶2 000)、S100A4(1∶500)、TGF-β1(1∶1 000)、TGF-βR1(1∶1 000)、SMAD2(1∶1 000)、SMAD3(1∶1 000)、p-SMAD2(1∶1 000)和p-SMAD3(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜；二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h；ECL超敏發光液發光；Image J軟件分析條帶的灰度值。目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/內參蛋白灰度值。

1.10 統計分析

2 結果

2.1 復方精油可干預PM2.5對MHC細胞相關功能的改變

本實驗室前期研究證明濃度為500 μg/mL的PM2.5可誘導MHC細胞發生EndMT[13]。通過MTT法檢測10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7[(V1/V)%]復方精油單獨作用MHC細胞48 h后細胞活性的改變，選擇10-5[(V1/V)%]作為復方精油干預細胞時的藥物濃度(P<0.01，圖1)。

圖1 藥物濃度實驗Fig.1 The experiments of drug concentration注：與CEOs單獨作用MHC細胞0 h后細胞活性的改變，*P<0.05，**P<0.01。Note:*P<0.05,**P<0.01 vs the 0 h group.

PM2.5作用細胞24 h后明顯提高了MHC細胞的活性(P<0.01)；在36 h和48 h時MHC細胞的活性最高(P<0.000 1)，但復方精油組的細胞活性并沒有顯著改變(見圖2C)。遷移實驗中，PM2.5組和復方精油組分別作用細胞36 h后，兩組細胞遷移能力差異明顯(P<0.05，圖2A和2B)，復方精油可減弱PM2.5對細胞遷移能力的影響。

圖2 細胞功能實驗結果Fig.2 The result of cell function experiments注：B.PM2.5組與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01，復方精油組與PM2.5組相比，#P<0.05；C.PM2.5組和復方精油組MHC細胞不同時間下的細胞活性變化，與0 h相比，*P<0.05，**P<0.01，****P<0.000 1。Note:B.The control group vs the PM2.5 group,*P<0.05,**P<0.01;The PM2.5 group vs the PM2.5+CEOs group,#P<0.05.C. *P<0.05,**P<0.01,****P<0.000 1 vs the 0 h group.

2.2 復方精油可緩解PM2.5誘導MHC細胞EndMT的進程

PM2.5分別作用MHC細胞0、6、12、24、36、48 h。結果表明，S100A4、Col1和Acta2的表達量明顯提升,CDH5和CD31的表達量明顯下降，提示PM2.5誘導MHC細胞發生EndMT[13]。復方精油分別干預MHC細胞6、12、24、36、48 h，其對PM2.5誘導產生的EndMT有良好的緩解作用，尤其是在蛋白表達水平上。復方精油干預24 h后，Acta2和S100A4的蛋白表達量下降趨勢尤為明顯(P<0.001，P<0.01)，而復方精油對Col1的緩解作用主要體現在復方精油干預36 h后(36 h，P<0.05；48 h，P<0.05，見圖3)。

表2 復方精油組中MHC細胞的COL1α1、CD31、CDH5和Acta2 mRNA變化情況

圖3 復方精油可緩解PM2.5誘導MHC細胞EndMT的進程Fig.3 CEOs can alleviate EndMT in MHC cells exposed to PM2.5注：與6 h組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。Note:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 vs the PM2.5 + CEOs group at the 6 h point.

2.3 復方精油通過調節TGF-β1/SMAD3/p-SMAD3通路抑制PM2.5誘導的EndMT

本實驗室前期研究證明PM2.5通過激活TGF-β1/SMAD3/p-SMAD3通路誘導MHC細胞發生EndMT[13]。Western blot結果顯示，與PM2.5組相比，在復方精油組中，TGF-βR1和p-SMAD2/3均有下降趨勢，其中TGF-βR1(P<0.05)和p-SMAD3(P<0.01)下降顯著(見圖4)。

圖4 復方精油可降低PM2.5誘導下TGF-β1/SMAD3/p-SMAD3信號通路的表達Fig.4 CEOs can reduce the expression of TGF-β1/SMAD3/p-SMAD3 pathway induced by PM2.5注：復方精油組與PM2.5組比較，*P<0.05，**P<0.01；PM2.5+SB431542組與PM2.5組比較，##P<0.01。Note:The PM2.5 group vs the PM2.5+CEOs group,*P<0.05 and **P<0.01;The PM2.5 group vs the PM2.5+SB431542 group,##P<0.01.

與此同時，在復方精油組中，CD31的蛋白表達量增加明顯(P<0.05)，Col1、Acta2和S100A4的表達均具有下降趨勢(見圖5)。綜上所述，復方精油可通過下調TGF-βR1的表達，降低下游靶分子p-SMAD3的表達從而抑制EndMT的發生。

3 討論

PM2.5是最受關注的空氣污染物之一。因其顆粒小，較易到達人體的肺泡和血液中，從而加快已患肺部疾病人群的疾病進程。血管內壁的內皮細胞與血液直接接觸，對血液中的異物刺激具有明顯的異質性。處于EndMT進程的內皮細胞是成纖維細胞的來源之一，不僅導致成纖維細胞大量增加，同時會使毛細血管床密度減少，加重組織缺氧、缺血，從而加速肺纖維化進程。實驗室前期試驗已證明PM2.5可誘導MHC細胞發生EndMT，Acta2、Col1和S100A4的蛋白表達量上升，CD31和CDH5的表達下降，說明PM2.5可使小鼠肺微血管內皮細胞發生EndMT，S100A4的蛋白表達量的增加也證實了EndMT在肺纖維化中具有重要的作用[13]。

本實驗采用的復方精油主要成分為α-蒎烯(16.54%)、桉葉素(16.7%)和薄荷醇(12.86%)等[12]。桉葉素是腫瘤壞死因子-α的阻遏劑，可有效抑制哮喘和慢性肺阻塞疾病的惡化過程，具有潛在的類固醇抗炎藥物的作用[14]。α-蒎烯具有抗氧化和抗菌作用，對腫瘤細胞A549顯示一定的抑制活性[15]。薄荷醇能夠阻斷血管平滑肌的L型鈣通道，對心血管疾病起到一定的治療作用[16]。本實驗發現，PM2.5可誘導處理MHC細胞48 h時，MHC細胞的增殖能力和遷移能力達到頂峰，但在復方精油組中，MHC細胞的整體功能并沒有因PM2.5的誘導而發生顯著變化。復方精油干預36 h后，Acta2和Col1的蛋白表達量明顯減少，提示復方精油對EndMT的發生具有良好的緩解作用。

研究發現，TGF-β在肺臟的發育、損傷和修復的過程中扮演重要的角色，其可通過激活TGF-β1受體促進細胞外基質的合成，并對肺纖維化的發病機制起到調控作用。前期實驗已經發現，PM2.5處理MHC細胞48 h后，TGF-β1、TGF-βR1和p-SMAD3的蛋白表達量增加，但在PM2.5組中加入SB431542 48 h后，TGF-βR1和p-SMAD3的表達減少，因SMAD蛋白磷酸化是TGF-β1信號通路的典型指標，由此可見，PM2.5可通過調節TGF-β信號通路，刺激TGF-β1轉化為活性形式去激活TGF-βR1，TGF-βR1被激活后與SMAD3結合，p-SMAD3的過度表達可促進間充質細胞標志物表達的增加和膠原的積累[13]。而在復方精油組中，TGF-βR1和p-SMAD3的蛋白表達量明顯下降，復方精油通過抑制TGF-βR1的激活降低p-SMAD3的表達，從而抑制PM2.5誘導的EndMT發生。

由此推斷，復方精油可通過抑制TGF-β1/SMAD3/p-SMAD3信號通路的表達減緩PM2.5誘導肺血管內皮細胞EndMT的發生。這些發現為PM2.5暴露后肺部EndMT的損傷修復和復方精油的干預方案提供了理論基礎。