基于網絡藥理學和分子對接技術的生姜揮發油治療頭風病作用機制研究

晏 菲，高佳蓉，張小飛，鄒俊波，賈妍卓，王雯翡，史亞軍

陜西中醫藥大學藥學院 陜西省中藥基礎與新藥研究重點實驗室，咸陽 712046

“頭風”最早記載于《神農本草經》，“白鮮，味苦，寒。主治頭風”?！栋Y治準繩·頭痛》云：“醫書多分頭痛頭風為二門，然一病也，但有新久去留之分耳。淺而近者名頭痛，其痛卒然而至，易于解散速安也。深而遠者為頭風，其病作止不常，愈后遷觸復發也。”現代醫學認為，頭風病是一種慢性陣發性頭痛為主要表現的疾病，相當于西醫的偏頭痛、緊張性頭痛和叢集性頭痛等原發性頭痛。發病間歇期間狀如常人，一旦受到誘因刺激，便頭痛劇烈，每次發作性質相似，病程較長，容易反復發作。僅偏頭痛一項在全球的發病率為8.4%～28%，終生發病率約為14.0%，大約18.2%的女性和6.5%的男性患有偏頭痛[1]。偏頭痛在全球的傷殘調整生命年數(disability-adjusted life-years，DALYs)從1990年到2015年增加了49.5%，為僅次于卒中的第二大DALYs[2]。西醫治療以應用非甾體類抗炎藥、曲普坦類藥物、阿片類藥物、麥角類制劑為主，但有較大的副作用，且易反復。傳統口服中藥服藥時間長，且不能立即緩解癥狀。針灸治療可疏通經絡，改善患者血管內皮細胞功能，但僅能減輕疼痛強度，減少發作次數、縮短持續時間，需與藥物結合才能起到更好的效果。

生姜是姜科多年生草本植物姜Zingiberofficinale Rosc.的新鮮根莖。味辛，性微溫。具有解表散寒，溫中止嘔等功效[3]。我國傳統醫學使用生姜治療頭風病早有記載，《名醫類案》曰：“以生姜自然汁少許，灌入鼻中，其痛立止”治療頑固性頭風痛?，F代研究表明，生姜揮發油具有鎮痛、興奮與鎮靜，抗氧化和對缺血性腦損傷的保護作用，對中樞神經系統有興奮和抑制的雙向調節作用[4]。生姜揮發油脂溶性強，極性較小，而鼻黏膜為脂質膜，極性小、脂溶性強的物質易于通過，本研究擬將生姜揮發油制成鼻腔給藥制劑，可經“鼻-腦” 通路向腦區高效遞藥而呈現顯著的腦靶向作用[5]，應用網絡藥理學的方法分析生姜揮發油、頭風病、靶點之間作用的關系，構建“化合物—靶點—通路—疾病”間的多層次網絡關系，對生姜揮發油治療頭風病的作用機制進行探討，為后期制劑研究提供一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

BT-25S型十萬分之一電子天平(賽多利斯上海貿易有限公司)；Agilent 7890B/5977B氣相色譜-質譜(GC-MS)聯用儀(美國安捷倫公司)。

生姜(購于陜西西安市農貿市場，經陜西中醫藥大學王繼濤高級實驗師鑒定為姜科姜屬植物姜ZingiberofficinaleRosc.的新鮮根莖)。乙酸乙酯、無水硫酸鈉為分析純。

1.2 方法

1.2.1 生姜揮發油化學成分的測定

照《中國藥典》2020版一部生姜項下揮發油提取方法提取揮發油，生姜破碎成小塊，加10倍量水，浸泡30 min，水蒸氣蒸餾法提取6 h，收集揮發油，以適量乙醚溶解，無水硫酸鈉脫水干燥后備用[6]。

采用GC-MS技術測定生姜揮發油的化學成分。氣相色譜條件：Agilent HP-5 ms(30 m×250 μm×0.25 μm)毛細管色譜柱，載氣為氦氣，進樣量1 μL，分流比5:1，分流流量5 mL/min，程序升溫初始溫度70 ℃(10 min)，10 ℃/min至95 ℃，5 ℃/min至125 ℃，6 ℃/min至240 ℃，1 ℃/min至260 ℃。質譜條件：EI離子源，離子源溫度250 ℃，四極桿溫度150 ℃，掃描質量范圍(m/z)20～450 amu，溶劑延遲3 min，采用DataAnalysis將閾值調為21，篩選化學成分[7]。

1.2.2 生姜揮發油作用靶點的預測

利用GC-MS測定的生姜揮發油化學成分借助TCMSP和Swiss Target Prediction在線分析工具對生姜揮發油的靶點進行預測。

1.2.3 頭風病疾病相關靶點的預測

頭風病相當于現代醫學的偏頭痛、緊張性頭痛、叢集性頭痛等原發性頭痛。為了較完全的預測頭風病疾病的靶點，以頭風病(head wind disease)、偏頭痛(migraine)、緊張性頭痛(tension headache)、叢集性頭痛(cluster headache)作為關鍵詞，在Drugbank、OMIM和DisGeNET數據庫對頭風病疾病相關靶點進行檢索。

1.2.4 生姜揮發油化學成分—頭風病疾病靶點的交集

將生姜揮發油化學成分的靶點與頭風病疾病的靶點分別導入在線網站Venny 2.1.0中繪制維恩圖，重疊部分為兩者的交集，即生姜揮發油化學成分直接作用于頭風病的靶點。

1.2.5 “成分—靶點”網絡的構建

將生姜揮發油化學成分與1.2.4中的交集靶點分別導入Cytoscape 3.7.2軟件中，構建生姜揮發油化學成分—交集靶點信息網絡。在信息網絡中，邊表示蛋白與蛋白的相互關系，線條的粗細代表關聯度等級。

1.2.6 蛋白—蛋白相互作用(PPI)網絡的構建

將1.2.4中獲得的交集導入String中獲取PPI網絡功能富集分析，將結果以TSV文件保存并上傳至Cytoscape 3.7.2軟件對靶點進行可視化分析，得到生姜揮發油治療頭風病靶點的PPI網絡并對其進行拓撲分析。

1.2.7 GO富集分析與KEGG富集分析

R語言ClusterProfiler包[8]可以對基因集合進行統計分析和可視化。利用ClusterProfiler包對交集靶點進行GO和KEGG富集分析，得到與生姜揮發油治療頭風病生物過程、細胞組分、分子功能及主要通路等有關的富集項。

1.2.8 分子對接

利用Discovery Studio 4.0軟件進行分子對接。在生姜揮發油治療頭風病靶點的PPI網絡圖中選取核心靶點，借助PDB數據庫(https://www.rcsb.org/)找出靶點score值排序靠前的靶點蛋白結構，配體為該靶點所對應的化合物，利用Drugbank在線平臺找出核心靶點對應的陽性藥物并在Pub Chem中下載陽性藥物和所對應化合物的2D結構。將整理好的靶點蛋白3D結構和對應化合物及陽性藥物的2D結構導入Discovery Studio，使用DOCK ligand(libDock)進行分子對接，得到核心靶點蛋白和對應化合物及陽性藥物的相互作用關系圖。

2 結果

2.1 生姜揮發油的化學成分

通過GC-MS測定出生姜揮發油的化學成分有53種(見表1)，成分總離子譜圖見圖1。

表1 生姜揮發油化學成分

續表1(Continued Tab.1)

圖1 生姜揮發油成分總離子譜圖Fig.1 Total ion spectrum of ginger volatile oil

2.2 生姜揮發油化學成分作用靶點的收集

將生姜揮發油的化學成分在TCMSP和Swiss Target Prediction數據庫進行作用靶點預測，共獲得作用靶點3 816個，刪除重復項，獲取生姜揮發油化學成分靶點509個。

2.3 頭風病基因靶點的收集

通過Drugbank、OMIM和DisGeNET數據庫收集頭風病疾病的基因靶點共1 507個，刪除重復項，得到靶點915個。

2.4 生姜揮發油化學成分—頭風病疾病靶點的交集結果

利用檢索得到的生姜揮發油的509個靶點與頭風病的915個疾病靶點繪制維恩圖，得到交集基因130個(見圖2)。說明生姜揮發油治療頭風病可能是通過這130個靶點發揮作用。

圖2 生姜揮發油化學成分靶點與頭風病疾病靶點維恩圖Fig.2 Venn diagram of chemical component target of ginger volatile oil and head wind disease target

2.5 “成分—靶點”網絡模型的構建

將2.4得到的交集靶點，導入Cytoscape 3.7.2軟件中建立 “生姜化學成分—交集靶點”網絡，網絡由178個節點組成1 400條邊，其中最大自由度值為86，平均自由度為14.034(見圖3)。圖中左邊淺藍色三角代表生姜揮發油的化學成分，右邊紅色圓圈代表藥物—疾病的交集靶點，大小根據自由度排序，展示成分與各交集靶點之間的關系。

圖3 “生姜揮發油化學成分-交集靶點”網絡圖Fig.3 Network diagram of "chemical component of ginger volatile oil-intersection target"

2.6 PPI網絡構建

利用String網站對130個交集基因進行分析，通過Cytoscape 3.7.2軟件對分析得到的數據進行可視化分析，得到生姜揮發油治療頭風病靶點的PPI網絡并進行拓撲分析。根據度的大小得到62個主要節點，642條邊，平均自由度為16.726(見圖4)。即62個頭風病相關的關鍵靶點和642條與頭風病靶點蛋白質相互作用關系，圖中每個圓圈代表每個交集靶點，大小及顏色深淺顯示其自由度的大小。

圖4 生姜揮發油治療頭風病的靶點PPI網絡圖Fig.4 PPI network of ginger volatile oil in the treatment of head wind disease target

在生姜揮發油治療頭風病作用PPI網絡中，APP、OPRM1、ADRA2A、ADRA2C、HTR1A、DRD2、DRD4、DRD3、ADRA2B、OPRK1是度值最大的10個節點，即生姜揮發油治療頭風病的關鍵靶點，可能在生姜揮發油治療頭風病的過程中具有重要作用。

2.7 GO富集分析與KEGG富集分析

2.7.1 生物過程(BP)分析

對生姜揮發油治療頭風病的潛在靶點進行GO分析，BP分析得到1 148個富集項，按照顯著性大小排序，前20項最具顯著性的BP見圖5，生姜揮發油治療頭風病和與環核苷酸第二信使偶聯的G蛋白偶聯受體信號通路、血管管徑調節、循環系統中的血管突起、腺苷酸環化酶調節G蛋白偶聯受體信號通路、血管內徑負調控等生物過程密切相關。通過Clusterprofiler包構建BP分析GO交互網絡(見圖6)，圖中大紅色節點代表著更顯著的路徑。

圖5 生姜揮發油治療頭風病潛在靶點GO富集分析(BP)Fig.5 GO enrichment analysis of potential targets of ginger volatile oil in the treatment of head wind disease(BP)

圖6 生物過程(BP)重點通路圖Fig.6 Key pathway map of biological process

2.7.2 細胞組分(CC)分析

CC分析得到72個富集項，前20項最具顯著性的CC見圖7，生姜揮發油治療頭風病與突觸后膜、突觸膜、突觸后膜的組成部分、突觸后膜的固有成分以及突觸膜的整體成分等細胞組分密切相關。CC分析GO交互網絡見圖8。

圖8 細胞組分重點通路圖Fig.8 Key pathway map of cellular component

2.7.3 分子功能(MF)分析

MF分析得到141個富集項，前20項最具顯著性的MF見圖9，生姜揮發油治療頭風與G蛋白偶聯胺受體活性、神經遞質受體活性、G蛋白偶聯神經遞質受體活性、5-羥色胺受體活性等分子功能密切相關。MF分析GO交互網絡見圖10。

圖9 生姜揮發油治療頭風病潛在靶點GO富集分析(MF)Fig.9 GO enrichment analysis of potential targets of ginger volatile oil in the treatment of head wind disease(MF)

圖10 分子功能重點通路圖Fig.10 Key pathway map of molecular function

2.7.4 KEGG通路富集分析

KEGG通路富集結果見圖11，共得到77個富集項，前20項最具顯著性的通路見圖8。結果顯示，神經活性配體—受體相互作用通路是最顯著的代謝通路，可能是生姜揮發油治療頭風病最重要的通路，Ca2+信號通路、含血清素的神經突觸、cAMP信號通路、cGMP-PKG信號通路等可能是較重要的通路。血清素5-羥色胺(5-HT)是含血清素的神經突觸通路中發揮作用的重要物質，作用過程見圖12。

圖11 生姜揮發油治療頭風病潛在靶點KEGG通路富集分析Fig.11 KEGG pathway enrichment analysis of potential targets of ginger volatile oil in the treatment of head wind disease

圖12 生姜揮發油治療頭風病的重要通路-含血清素的神經突觸Fig.12 An important pathway of ginger volatile oil in the treatment of head wind disease-serotonergic synapse

2.8 分子對接分析

為了進一步說明靶點蛋白與對應化合物之間的結合活性，本研究選擇生姜揮發油治療頭風病作用蛋白交互網絡中度值較高的3個核心靶點OPRM1、ADRA2A和DRD2，與其對應的化合物進行分子對接，結合活性越高，得分越高(見表2)。其中橙花叔醇與OPRM1，可巴烯與ADRA2A，金合歡醛與DRD2的結合活性最高。利用Discovery Studio 4.0軟件進行陽性藥物驗證實驗和分子對接，并選擇與表2中對接得分最高的化合物即核心成分進行比較，對比情況見表3。核心靶點與核心成分、陽性藥物的對接結果見圖13。結果表明，3個核心靶點與核心成分的對接得分均高于與陽性藥物的對接得分。

圖13 核心靶點與核心成分、陽性藥物分子對接圖Fig.13 Molecular docking results of core targets combined with core components and positive drugs注：A.OPRM1-橙花叔醇；B.OPRM1-嗎啡；C.ADRA2A-可巴烯；D.ADRA2A-溴莫尼定；E.DRD2-金合歡醛；F.DRD2-阿樸嗎啡。Note:A.OPRM1-Nerolidol;B.OPRM1-Morphine;C.ADRA2A-Copaene;D.ADRA2A-Brimonidine;E.DRD2-2,6,10-Dodecatrienal,3,7,11-trimethyl-,(E,E)-;F.DRD2-Apomorphine.

表2 核心靶點與對應化合物結合活性得分表

表3 核心靶點與核心成分、陽性藥物的結合活性得分對比

3 討論

中醫學認為，頭風病其病因為內感和外傷兩端，臨證時難以用單一病機概括，為風、瘀、寒、痰、虛雜合致病?！吨T病源候論》謂“頭面風者，是體虛，諸陽經脈為風所乘”。風邪為最主要的致病因素，與頭風病的發作與反復有密切關系。Wu等[9]整理了秦漢至晚清1911年現存的治療頭痛的古代醫學論著及文獻資料，解表藥及辛味藥物使用頻次為最高，以解表藥祛除外感風寒或風熱，其中生姜在所有藥物中的使用頻次占第5位。

本研究運用網絡藥理學對生姜揮發油的主要活性成分、作用靶點進行篩選并與頭風病的靶點進行交集，建立生姜揮發油化學成分—交集靶點信息網絡進行生姜揮發油治療頭風病的研究。研究表明，生姜揮發油治療頭風病的主要活性物質是乙酸龍腦酯、合成右旋龍腦、α-松油醇、eudesma-4,6-二烯、橙花叔醇、檸檬醛、可巴烯以及β-桉葉醇等。通過PPI網絡分析篩選出APP、OPRM1、ADRA2A、ADRA2C、HTR1A、DRD2、DRD4、DRD3、ADRA2B、OPRK1等62個可能在生姜揮發油治療頭風病過程中發揮重要作用的關鍵靶點以及642條頭風病靶點蛋白質相互作用關系。

為進一步探討生姜揮發油治療頭風病的潛在機制，利用生姜揮發油活性成分和頭風病疾病的交集靶點進行了GO和KEGG富集分析。GO富集分析共得到1 361個富集項，包括生物過程中與環核苷酸第二信使偶聯的G蛋白偶聯受體信號通路、血管管徑調節、循環系統中的血管突起等；細胞組分中的突觸后膜、突觸膜、突觸后膜的組成部分等；分子功能中的G蛋白偶聯胺受體活性、神經遞質受體活性、G蛋白偶聯神經遞質受體活性、5-羥色胺受體活性等。KEGG富集分析得到了77個富集項，包括神經活性配體—受體相互作用通路、Ca2+信號通路、含血清素的神經突觸通路等。頭風病的發生與多種神經遞質及受體有關，其為陣發性神經系統疾病，可通過調節神經活性配體—受體相互作用通路發揮鎮痛作用[10]。文獻研究表明，偏頭痛與Ca2+信號通路密切相關，抑制性突觸在調節疼痛信號傳導和偏頭痛產生的調制電路中起著關鍵作用，P/Q型Ca2+通道通常對許多中樞突觸的突觸前Ca2+進入和神經遞質釋放至關重要，能夠抑制或興奮神經傳遞[11]。含血清素的神經突觸又稱5-HT神經通路，其與控制進食行為，體溫調節和睡眠等有關。偏頭痛患者5-HT受體結合率降低，腦內5-HT水平升高，許多抗偏頭痛藥物與5-HT及其受體相互作用從而發揮治療作用[12,13]。富集分析結果顯示，生姜揮發油可能通過調節關鍵靶蛋白，參與神經活性配體—受體相互作用，Ca2+信號通路以及含血清素的神經突觸等相關通路發揮鎮痛治療作用。

為進一步說明蛋白與相應配體化合物的結合活性，結合文獻報道，在生姜揮發油治療頭風病作用PPI網絡度值較大的靶點中選取3個核心靶點OPRM1、ADRA2A、DRD2，在Drugbank里找出與蛋白有關的3個陽性藥嗎啡、溴莫尼定、阿樸嗎啡，配體即為該蛋白所對應的成分化合物。利用Discovery Studio 4.0對該蛋白和配體及陽性藥進行分子對接，結果表明，該蛋白與配體的結合活性分數高于與陽性藥的結合活性分數，即蛋白與配體的結合活性較高。在核心靶點中，OPRM1基因是μ阿片受體的編碼基因，μ阿片受體在機體的痛覺敏感性和內源性鎮痛等功能中發揮重要調節作用，尤其在調控神經系統產生鎮痛效應方面有非常重要的作用[14]。ADRA2A屬于G蛋白偶聯受體，存在于去甲腎上腺素神經元中，刺激和抑制突觸后中樞神經系統信號通路[15,16]。ADRA2A受體的激活會產生選擇性的顱腦血管收縮作用[17]。DRD2主要位于腦部，是黑質紋狀體多巴胺能神經元的主要靶點[18]。偏頭痛患者發作期內源性多巴胺釋放減少和波動[19]。DRD2基因多態性與中國漢族女性偏頭痛的發病風險顯著相關，偏頭痛患者血漿DRD2水平較高，女性偏頭痛患者的DRD2水平明顯高于男性偏頭痛患者[20]。

本研究應用網絡藥理學的方法證實了生姜揮發油治療頭風病的作用，預測了生姜揮發油治療頭風病的潛在靶點以及治療頭風病作用相關的信號通路和生物過程，揭示了生姜揮發油治療頭風病是多成分、多靶點、多通路的作用結果。本研究對生姜揮發油治療頭風病的作用機制及實驗驗證提供了理論依據，以期對后期的制劑研究、藥物開發和臨床應用提供參考。