基于數據挖掘和網絡藥理學分析《中國藥典》治療心悸藥物配伍規律及其作用機制

徐寧陽，王 群，劉 悅，張 哲，楊關林*

1遼寧中醫藥大學，沈陽 110847；2遼寧中醫藥大學附屬醫院，沈陽 110032

心悸是中醫病證名，《傷寒雜病論》稱之為 “心動悸”“心下悸”“心中悸”“驚悸”。患者自感為悸動不安、驚惕心慌甚至不能自主。情志不遂或者過度勞累時易發作，多伴有氣短、耳鳴、眩暈、胸悶、憋氣等癥狀。根據癥狀心悸在西醫中屬于心律失常范疇，是我國最為常見的心血管疾病類型，具有高發生率、死亡率，疾病臨床類型較多，常見有心動過速、心動過緩、心房顫動、傳導異常等[1,2]。如果不加以控制，不僅會對心肌細胞造成不可逆的損傷，還會引發心肌梗死等嚴重并發癥，對患者的生活有著難以改善的影響，降低患者的生活質量的同時也會危急患者的生命。目前西醫治療多以抗心律失常藥物治療，但大量實踐表明仍有患者對西醫治療會產生復發或者藥物不能耐受等不良后果[3]。近幾年由于中醫藥在臨床治療中廣泛應用，故有學者提出以中藥治療心律失常，心悸最早由張仲景提出，因此通過古代的中藥研究，如何能更好的醫治心悸，其具體分子靶點是怎樣的，本研究將從2015年《中國藥典》(一部)(以下簡稱《中國藥典》)入手，挖掘《中國藥典》中用于治療心悸中成藥的組方規律，分析出高頻藥物。

《中國藥典》是將藥品從研制到生產、從經營到使用管理等相關從業者必須遵守的法定依據，是我國保證藥品質量的法典。在前期文獻研究中發現有關學者已對藥典所收載的中藥飲片或毒性藥材展開歸類及配伍規律的研究[4]；對收載的成方制劑開展主治病證的中成藥組方規律分析[5,6]；對《中國藥典》收載的成方制劑和單味制劑進行系統數據挖掘，但均未發現對治療某一相關疾病尤其心血管疾病的中成藥進行數據挖掘及分析規律，故本研究以2015年版《中國藥典》中的治療心悸的中成藥的方劑名稱、中藥成分、中藥用量、功能與主治為研究對象，采用由中國中醫科學院中藥研究所研發的V2.5版中醫傳承輔助平臺分析用藥規律[7,8]，通過其主要功能關聯規則Apriori算法、復雜系統熵聚類等無監督數據挖掘方法，分析中藥的使用頻次及中藥之間的關聯規則、處方規律以及新方的預測。

由上述軟件分析得出的用藥規律后，得出治療心悸的高頻藥物，通過由Hopkins等人提出的探索中藥與疾病直接關系的科研方法—網絡藥理學，系統的分析和挖掘，構建“中藥-有效成分-疾病靶點-疾病”之間的關系，能夠為中藥機制分析及藥物研發提供新思路、新方法[9,11]。由于中藥具備多成分、多靶點的因素，所以網絡藥理學正是能夠更好的闡述中藥作用于心悸的作用機制。

1 資料和方法

1.1 治療心悸的中成藥收集

檢索2015年《中國藥典》(一部)中成方制劑與單位制劑部分的藥品說明書，在功能與主治中選取關鍵詞為：“心悸”“心律失常”等字樣用于治療心悸的中成藥。在選取后的中成藥中排出劑型不同但藥方一致的方劑，如：歸脾丸、歸脾合劑、歸脾顆粒計為1個中成藥。

1.2 數據的錄入、核對與處理

在《中國藥典》中，將符合“1.1”條件的中成藥方中的方劑名稱、中藥成分、中藥用量、功能與主治錄入Microsoft Excel for Mac；對所納入的中藥的名稱進行統一規范，如：沙棘鮮漿規范為沙棘、醋龜甲規范為龜甲。將所涉及的藏藥，蒙藥，苗藥或者中藥為同一藥材但名稱不同的，按照中國藥典及十三五規劃的中藥學教材標準統一錄入。規范后的數據錄入中醫傳承輔助平臺V2.5，采用兩人輸入，第三人校對審核，確保數據嚴謹、真實。

1.3 數據分析

1.3.1 中醫藥傳承輔助平臺對用藥規律的分析與預測

將“1.2”所錄入的數據在中醫藥傳承輔助平臺V2.5相應模塊中進行“頻次統計”，“組方規律”，“新方分析”的用藥規律分析及預測。

1.3.2 網絡藥理學對藥物的深度分析

將“1.3.1”中所得到的最高頻藥物，在中醫藥系統藥理學平臺(The Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)[12]先后進行中藥有效成分篩選，同時在GeneCards數據庫以心律失常(arrhythmia)為關鍵詞，檢索心悸的相關疾病靶點，再使用Draw Venny Diagram在線程序構建中藥-疾病交集靶點，在Cytoscape 3.7.1中構建藥物-疾病-靶基因網絡圖，并將基因提交至String網站繪制蛋白質相互作用關系圖(PPI)，再利用R3.6.1軟件進行GO富集分析和KEGG通路富集分析，來預測《中國藥典》中治療心悸的最高頻藥物的可能作用機制。

2 結果

2.1 藥頻統計--治療心悸的中成藥中各中藥的使用頻率

在《中國藥典》中共選取到93個中成藥方，其中14個為劑型不同但存在藥方一致，故剩余79個有效中成藥方。根據《中國藥典》，對79個有效中成藥中的176味中藥進行“頻次統計”，得到應用頻次不少于8的中藥22個，其中用藥頻次最高的五位藥分別是：丹參31次；人參23次；麥冬18次；川芎和五味子各17次。詳見表1。

表1 《中國藥典》中治療心悸的中成藥的用藥頻次(≥8次)

2.2 關聯分析--治療心悸處方的組方規律分析

2.2.1 《中國藥典》中治療心悸常用藥對分析

根據Apriori算法，在設置支持度為7的情況下，得到25個高頻藥對。其中，出現頻度最高的四對配伍分別是：丹參-人參13次；川芎-丹參12次；麥冬-五味子和丹參-五味子各10次(詳見表2)。

表2 《中國藥典》中治療心悸處方中高頻藥對

續表2(Continued Tab.2)

2.2.2 《中國藥典》中治療心悸藥物應用規則分析

同樣在Apriori算法中，設置置信度0.6，得到9種應用規則，其中石菖蒲->丹參；紅花->川芎；當歸、遠志->酸棗仁的置信度最高，為0.875。規則詳見表3和圖1。

表3 《中國藥典》中治療心悸藥物規則分析

圖1 《中國藥典》中治療心悸藥物關聯規則可視化Fig.1 Visualization of association rules of drugs for treatment of arrhythmia in the Chinese Pharmacopoeia

2.3 聚類分析--基于熵聚類方法的新處方預測

在應用“新方分析”模塊中，設置相關度8，懲罰度2，通過無監督的熵層次聚類分析，得到核心組合16個，見表4。并進一步分析得到用于治療心悸新方組合10個(見表5，圖2)。

圖2 《中國藥典》中治療心悸藥物新處方網絡展示圖Fig.2 Network display diagram of new prescriptions for arrhythmia in the Chinese Pharmacopoeia

圖3 丹參活性化合物靶點與心悸靶點的交集基因Fig.3 Intersection genes between the target of Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma active compound and the target of arrhythmia

圖4 丹參與心悸蛋白質相互作用核心網絡圖Fig.4 The core network diagram of Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma involvement in arrhythmia protein interaction

表4 《中國藥典》中治療心悸藥物聚類核心組合

表5 《中國藥典》中治療心悸藥物新處方預測結果

2.4 網絡藥理學分析--高頻藥物丹參治療心悸的潛在作用機制分析

2.4.1 丹參的靶標預測結果

根據“2.1～2.3”所得到的最關鍵性藥物丹參進行網絡藥理學分析。在TCMSP中預測到丹參的65個有效成分(篩選要求OB大于30%，DL大于0.18[13,14])。具體信息見表6。

表6 丹參的有效成分表

2.4.2 丹參治療心悸的蛋白、基因分析

將TCMSP中得到的藥物靶點和在GeneCards數據庫中得到的疾病靶點進行交集基因預測，其中有79個交集靶點(見圖3)。在String網站中，生成PPI互作網絡圖(見圖4)。并根據其蛋白質-蛋白質作用數量，生成蛋白統計條圖(見圖5)。最后對65個中藥靶點(藍色)及79個疾病靶點(綠色)構建丹參-有效成分-疾病靶點-疾病的網絡圖，交集線比較集中的部分可能是其關鍵靶點，整個網絡中包括138個節點，642條邊，degree排名前五名的化合物有木犀草素(luteolin)、丹參酮(tanshinone)、4-亞甲丹參新酮(4-methylenemiltirone)、隱丹參酮(cryptotanshinone)、鼠尾草酚酮(salviolone)，排名前五的基因有環加氧酶(PTGS2)、β2腎上腺素能受體(ADRB2)、人源全長重組蛋白(SCN5A)、阿片受體編碼基因(OPRM1)、毒蕈堿型膽堿受體M1(CHRM1)(見圖6)。

圖5 蛋白統計條圖Fig.5 Protein statistics bar graph

圖6 丹參-有效成分-靶點-疾病網絡圖Fig.6 Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma-active ingredients-targets-disease network diagram

續表6(Continued Tab.6)

續表6(Continued Tab.6)

2.4.3 丹參治療心悸的通路可視化富集分析

為了進一步探究丹參對于心悸的作用功能及通路，利用R3.6.1軟件進行GO富集分析和KEGG通路富集分析，其中GO生物學功能分析得到結果見圖7。KEGG通路富集分析得到PI3K-AKT信號通路、IL-17信號通路、TNF信號通路等通路(見圖8)。

圖7 GO生物學功能富集分析圖Fig.7 Analysis diagram of GO biological function enrichment

圖8 KEGG通路富集分析圖Fig.8 KEGG pathway enrichment analysis diagram

3 討論

心律失常作為比較常見的心系疾病，是臨床心血管疾病常見癥狀，不及時治療可致惡性心律失常，嚴重者危及生命安全。中醫在治療心悸有著很好的療效。因此筆者在《中國藥典》中選取心悸進行數據挖掘與分析，得到高頻藥物丹參、人參、麥冬、川芎、五味子等。其中丹參，人參，麥冬等藥在Ling和Hao等[15,16]的心悸用藥規律分析中也是高頻用藥。雖然丹參是本文挖掘出的最高頻藥物，但這些高頻藥物又是如何作用在心律失常疾病的機理上，故本文后續通過網絡藥理學平臺對丹參治療心律失常進行了靶點分析。

3.1 心律失常疾病靶點分析

通過研究心律失常疾病的靶點中，發現心律失常與離子通道基因表達異常緊密相關，多個離子通道基因的突變可引起各種心律失常。目前，已知絕大多數的原發性心電異常都是由編碼各主要離子通道亞單位的基因突變引起的，統稱“離子通道病”。Nav1.5通道是人類主要的心臟鈉離子通道類型，由SCN5A基因編碼。近年來發現SCN5A基因突變與房性心律失常，室性心律失常，病態竇房結綜合征密切相關[17]。不僅如此，研究表明像ESR等靶點也能誘發心律失常[18]。除此之外，微循環障礙會對心血管造成影響，引發相關心血管疾病，因此有研究表明，丹參治療微循環障礙也主要體現在PTGS2上等[19]，不僅如此，也有相關研究表明，在丹參治療冠心病相關靶點中也與PTGS2、PTGS1密切相關[20]。并且丹參的活性化合物分子與相關心血管疾病治療密切相關，丹參通過作用于多個靶點來發揮藥理學作用，主要體現在PTGS1、PTGS2、ADRA1A、ADRA1B、CHRM2中[21]。

3.2 丹參治療心律失常的活性化合物預測

在我國丹參作為活血祛瘀之要藥，在治療心血管疾病已有兩千多年的歷史，丹參活性成分及丹參制劑具有一定的抗動脈粥樣硬化、改善心肌重構、抗心肌缺血、抗心律失常的心血管保護作用。但對心律失常的報道還是鮮見，通過本研究中發現，在預測的活性化合物中，丹參酮ⅡA通過減少體內MDA含量、加強SOD活力從而提高HUVEC細胞抗氧化應激損傷能力，降低細胞自噬水平達到保護血管的作用[22]，同時Sun等[23]研究發現，丹參酮IIA是一種特異性激活劑，可用于預防和治療由心肌細胞動作電位復極延遲和IKs通道功能降低引起的心律失常。不僅是丹參酮IIA，在丹參的活性化合物中丹酚酸B同樣重要，研究發現，丹酚酸B具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抑制細胞凋亡等多種藥理活性，在臨床可廣泛用于治療心腦血管疾病[24]。因此通過藥理學發現丹參的許多化合物都可以預防甚至治療心律失常。

3.3 丹參治療心律失常的信號通路研究

影響心律失常的原因有很多，其中心肌缺血再灌注后發生的心律失常是重要的臨床表現形式，因此提高心肌細胞的抗氧化能力，抑制細胞的過度自噬顯得非常重要，在這個過程中，藥理學研究發現可以上調PI3K信號通路的表達，進一步上調Akt和mTOR的表達，也就是通過PI3K/Akt/mTOR信號通路起到抗心肌缺血再灌注損傷致心律失常的作用[25]。不僅如此，在免疫應答方面，T輔助型細胞為T細胞的一種，主要有Th1、Th2及Th17三個亞型。其中Th17主要分泌IL-17、IL-17F等。大量實驗證明IL-17信號通路參與了心臟纖維化的進程[26]，而相關基礎研究也證實了IL-17參與了AngII誘導的心房纖維化，對心律失常的產生有促進作用。同時對于TNF通路而言，對心律失常相關研究報道鮮有發生，但發現其能夠通過誘導誘導型一氧化氮合酶的表達，從而導致微血管內皮細胞凋亡[27]，只能說TNF通路與微循環障礙的發生、發展密切相關，又因微循環障礙可能與心血管疾病有關，故可能對心律失常有影響。

4 結論

本文通過對《中國藥典》的數據挖掘，對治療心悸的中成藥有了系統的分析，并在結果上通過藥理學分析，得出丹參治療心悸的具體分子靶點機制，為后續的臨床選方用藥科研試驗提供參照。但因為篇幅有限，對人參，麥冬等高頻藥物亦可以進行后續相關研究，為臨床提供更多證據。