植物活性成分協同抗生素消減細菌耐藥性的研究進展

陳金玉，劉單陽，趙 勇,2,3，孫曉紅,2,3 *

1上海海洋大學食品學院；2農業部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室(上海)；3上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海 201306

抗生素是二十世紀初醫學上最偉大的發現之一，并被廣泛用于傳染性疾病的治療。但是隨著抗生素的長期和不合理使用，大多數易感細菌對抗生素產生了耐藥性。一旦細菌對某些抗生素產生耐藥性，不僅能夠通過基因垂直轉移將這種特性遺傳給子代，還能通過水平基因轉移傳遞給其他細菌。耐藥細菌的遺傳結構變化非常之快，以至于普通抗生素的有效性可能會在5年內喪失[1]。當前面對細菌耐藥性帶來的挑戰，全球主要的應對策略有：加強耐藥監測、合理使用抗生素、開發新型抗菌藥物和恢復或增強現有抗生素的抗菌活性等[2]。新藥的開發和實施是一個困難、耗時、昂貴的過程，并且新藥研發跟不上細菌耐藥性的變化[3]。截至目前，成功研發出新藥物這一目標還遠未實現。因此，恢復或增強耐藥菌對現有抗生素的敏感性是控制細菌耐藥性持續發展的有效措施。

植物活性成分具有抗菌、抗氧化、抗炎等功效，還具有不易產生耐藥性、體內代謝快、低毒無殘留等優點[4,5]。植物活性成分單獨使用或與抗生素聯合使用均具有廣泛的抗菌作用，與抗生素合用能有效恢復或增強現有抗生素對耐藥菌的抗菌活性，為消減細菌耐藥性提供一種新的策略。本文對細菌耐藥現狀、植物活性成分協同抗生素對耐藥菌的作用及其機制進行綜述，旨在為植物活性成分在消減細菌耐藥性的應用領域提供理論基礎。

1 細菌對抗菌藥物的耐藥現狀

細菌耐藥性主要分為固有耐藥性和獲得耐藥性兩大類，固有耐藥性是細菌與生俱來的，由染色體基因決定，細菌在進化過程中為了適應抗生素的存在或者代謝抗生素導致自身編碼蛋白質的普通基因(也稱為耐藥基因)被激活，并且永久性的遺傳給后代。獲得耐藥性是指細菌多次與抗菌藥物接觸后，為了適應生存環境，遺傳基因發生突變、代謝途徑改變，對抗生素的敏感性降低，從而產生耐藥性[6]。由于抗生素的不合理使用和濫用，加速了細菌耐藥性的發展，耐藥菌株不斷增多，耐藥水平不斷增強，耐藥譜逐漸擴大，細菌逐步發展成為單一耐藥菌、多藥耐藥菌甚至全耐藥菌。現如今，細菌耐藥問題在全球范圍內普遍存在，多藥耐藥菌及全耐藥菌的檢出率居高不下[7]。根據世界衛生組織(WHO)的報告，金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌和鏈球菌等已成為歐美地區最常見的醫院內感染和耐藥菌株，感染率高達50%，每年至少造成5萬人死亡[8,9]。據美國疾病控制和預防中心(CDC)估計，如果耐藥性水平持續上升，到2050年每年將導致1 000萬人死亡[10]。中國細菌耐藥性監測網(CHINET)數據表明，2005～2020年我國大多數的臨床分離菌株對常見抗菌藥物的耐藥率依然呈現遞增趨勢，革蘭氏陰性菌的耐藥率均呈現上升趨勢，且對碳青霉烯類抗生素的耐藥情況日益加重。其中肺炎克雷伯氏菌對亞胺培南的耐藥率從3.0%增長至26.4%，對美羅培南的耐藥率從2.9%上升至28.0%。此外，不動桿菌和銅綠假單胞菌對亞胺培南的耐藥率分別達到了76.7%和29.2%，對美羅培南的耐藥率分別為76.1%和24.5%[11]。

相比于抗生素在人類臨床上的過量使用，應用于動物的抗生素數量更加驚人。我國每年生產抗生素21萬噸，其中大約有54%用于飼養動物[12]。世界動物衛生組織(OIE)公布的數據顯示，食品動物消耗的抗生素約占全球生產抗生素總量的50%，而我國食品動物生產中抗生素的使用量達到了30%，高居全球榜首[13]。我國養殖使用的全部抗生素總量約為2.98×104t，所用抗生素主要分為促生長和治療2大類，其中，促生長使用方式的用量為1.54×104t，至少占全部使用的獸用抗生素比重達53%。據保守估計，2010～2030 年，應用于中國畜牧業的抗生素總量至少增加一倍，約達到全球消耗總量的1/3[14]。畜牧業和水產養殖業為了預防傳染病、促進生長及提高飼料轉化率，在動物飼料中長期過量添加抗生素，導致細菌產生耐藥性[15]。細菌耐藥性不僅對動物健康有影響，而且也嚴重威脅公共衛生，因為過度使用抗生素、加強動物生產系統和全球化之間的聯系，動物源耐藥菌可通過土壤排泄物、水環境、空氣以及食物鏈等將耐藥基因轉移給人體病原菌，導致人源性細菌產生耐藥性，從而導致臨床治療效果減弱。此外，耐藥基因的水平轉移不僅增加了在不同生態系統之間傳播多藥耐藥性細菌的風險，還嚴重威脅著畜牧業發展、人類生命健康、國家經濟和全球安全[16,17]。

由于抗生素在臨床和養殖業的廣泛使用，導致細菌耐藥問題日益加重，甚至出現了超級細菌。超級細菌可攜帶一種或多種耐藥基因，并且能通過質粒和轉座子等將耐藥基因在不同菌屬之間傳播。此外，它還可以水解幾乎所有的β-內酰胺類抗生素，包括被稱為“抗生素最后防線”的碳青霉烯類，從而導致抗生素的治療毫無效果，感染者死亡率大幅度增加，住院時間延長，住院率升高，治療費用增加，甚至還會陷入“無藥可醫”的窘境[18]。繼2009年首次報道了第一個轟動全球的攜帶新德里金屬β-內酰胺酶(NDM-1)的超級耐藥葡萄球菌后，2020年美國疾病控制和預防中心(CDC)又發現了兩種新的超級細菌(耳念珠菌和鮑曼不動桿菌)[19]。其出現的最可能原因是過去幾十年里抗菌藥物的廣泛使用，尤其是抗生素的濫用導致細菌在嚴峻的生存壓力下發生適應性突變。此外，細菌極強的進化和變異能力導致新的耐藥機制產生，因此，即使在各國嚴格的抗生素管理機制下超級細菌仍可能出現并威脅人類健康[20]。

2 植物活性成分協同抗生素對耐藥細菌的作用

2.1 生物堿類

生物堿是植物中普遍存在的一種活性物質，單獨或者與抗生素聯合使用能對多種耐藥菌發揮抗菌作用。生物堿與不同種類抗生素聯合作用后能顯著增強抗生素對多藥耐藥革蘭氏陰性菌的抗菌作用。Laudadio等[21]研究發現，小檗堿聯合妥布霉素對多藥耐藥銅綠假單胞菌(multidrug-resistantPseudomonasaeruginosa，MRPA)具有較強的抑菌效果，與單獨使用妥布霉素相比在24 h內活細胞數減少至少2 log。Jaktaji等[22]發現，從槐花中提取的槐花總堿(1.56 mg/mL)和環丙沙星(1.00 mg/mL)聯用對外排泵基因acrAB過表達的多藥耐藥大腸桿菌存在協同抗菌作用，分數抑制濃度指數(fractional inhibitory concentration index，FICI)為0.13，環丙沙星最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)降低了2.8倍，增強了耐藥菌對抗生素敏感性。此外，生物堿與抗生素對革蘭氏陽性菌也能發揮協同抗菌作用，Mgbeahuruike等[23]研究發現，胡椒堿單獨使用可以抑制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)，與四環素聯用時FICI的值為0.3，能有效恢復MRSA對四環素的敏感性。Zuo等[24]研究表明，黃連素能增強β-內酰胺類抗生素對MRSA的抗菌活性，這種明顯的協同作用表現為降低了抗生素的最低有效劑量，能最大程度地減少藥物的副作用。

2.2 黃酮類

黃酮類化合物廣泛存在于蜂蜜、水果、種子、蔬菜等多種植物及植物產品中，與多種抗生素聯合使用均能表現出對MRSA的協同抑制作用，Amin等[25]研究顯示，木犀草素、槲皮素兩種黃酮類化合物與頭孢曲松、亞胺培南合用對MRSA的FICI值為0.45～0.50，其它β-內酰胺類抗生素的MIC值也降低了2～16倍，表明上述兩種黃酮類化合物能不同程度地增強β-內酰胺類抗生素對MRSA的抗菌作用。Diniz-Silva等[26]發現，楊梅素、橙皮苷、根皮苷等多種黃酮類化合物與諾氟沙星聯用均對MRSA有一定的協同抗菌作用，諾氟沙星的MIC值與單獨使用時相比下降了4～16倍。黃酮類化合物聯合抗生素對耐藥菌具有廣譜協同抗菌活性，不僅能消減MRSA的耐藥性，還能調節多藥耐藥分枝桿菌的抗生素抗性[27]。Marini等[28]將亞抑制濃度的姜黃素與阿米卡星、克拉霉素、環丙沙星和利奈唑胺聯合作用，結果顯示它們對多藥耐藥分枝桿菌的FICI值分別為0.187 5、0.250 0、0.375 0和0.257 8，四種抗生素的MIC值也降低了4～128倍，表明姜黃素在很大程度上消減了多藥耐藥膿腫分枝桿菌對常用抗生素的耐藥性，是具有廣闊應用前景的抗菌協同劑。

2.3 多酚類

多酚類化合物主要由黃酮、酚酸、醌、單寧和香豆素等物質組成，與氨基糖苷類抗生素聯合應用對多重耐藥革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌均有較強的協同抗菌作用。Parvez等[29]研究發現，表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)與慶大霉素聯用能降低慶大霉素對多藥耐藥大腸桿菌(multidrug-resistantEscherichiacoli，MREC)和金黃色葡萄球菌的MIC值至少5倍，EGCG與慶大霉素聯合使用對兩種多藥耐藥菌的FICI值均為0.325，呈現出協同抗菌作用。多酚與四環素類抗生素聯合也具有消減細菌耐藥性的作用。Maisuria等[30]研究發現，通過將蔓越莓原花青素與四環素聯合使用，能將四環素對MREC、MRPA的MIC值分別降低128倍和32倍，表明對多數多藥耐藥革蘭氏陰性菌均具有一定程度的協同抗菌活性。此外，多酚與利福平聯用也能呈現出對多藥耐藥分枝桿菌的協同抗菌效果。Solnier等[31]發現，利福平與黃岑總黃酮聯合使用后MIC值降低了8倍，黃岑總黃酮不僅能顯著降低分枝桿菌對利福平的耐藥水平，還能增強抗生素的抗菌活性，具有潛在的消減耐藥性的功效。

2.4 萜類

萜類是植物精油的主要成分，具有抗菌作用。萜類化合物與β-內酰胺類、喹諾酮類抗生素聯用對肺炎克雷伯氏菌和大腸桿菌具有協同抗菌作用。Dhara等[32]測試肉桂醛與不同種類抗生素聯用對61株(28株大腸桿菌，33株肺炎克雷伯氏菌)多藥耐藥臨床分離株的耐藥性的消減作用時發現，肉桂醛與頭孢噻肟聯合應用能對75.0%的大腸桿菌和60.6%的肺炎克雷伯氏菌發揮協同作用。類似的，在39.6%的大腸桿菌和42.4%的肺炎克雷伯氏菌中也能觀察到肉桂醛與環丙沙星之間的協同作用。另外，肉桂醛可使頭孢噻肟和環丙沙星的MIC降低2～1 024倍，顯著增強了多藥耐藥大腸桿菌和肺炎克雷伯氏菌對這兩類抗生素的敏感性。Mohamed等研究[33]證實，百里香酚和薄荷醇與環丙沙星合用也具有逆轉肺炎克雷伯氏菌耐藥性的作用，可最大程度地減少所使用的抗生素濃度，大幅度地降低潛在的毒副作用。

2.5 其它類化合物

植物中的其它次生代謝物，如凝集素、硫代葡萄糖苷、多糖等均具有廣泛的抑菌活性,因此可將植物活性成分與抗生素混合后發揮協同抗菌作用。Santos等[34]通過將紫丁香凝集素與慶大霉素按最佳比例混勻后注射小鼠體內連續治療10天后發現，紫丁香凝集素能增強慶大霉素對MRSA、MREC的抗菌活性并提高小鼠存活率，慶大霉素對MREC和MRSA的MIC值分別降低3倍和5倍。芥子油苷對多藥耐藥幽門螺桿菌具有較強的抗菌活性，與萬古霉素、苯唑西林等抗生素聯用能有效提高MRSA對甲氧西林的敏感性[35]。Zhai等[36]通過在南美白對蝦飼料中添加單一的黃芪多糖、氟苯尼考和兩者混合物，記錄5天內蝦的死亡率。結果顯示，混合組的累積死亡率顯著低于單獨使用黃芪多糖或氟苯尼考組，黃芪多糖與氟苯尼考合用能對副溶血性弧菌發揮協同抗菌作用，減少漁藥的投入成本，降低耐藥性的發生率。

3 植物活性成分與抗生素協同抗菌的作用機制

植物活性成分可以通過改變抗生素的目標靶點、抑制抗生素水解/修飾酶的活性、促進膜的滲透性/抑制外排泵的活性等途徑恢復或者增強抗生素對耐藥菌的抗菌活性。不同種類的植物活性成分和抗生素協同抗菌的作用機制如表1所示。

表1 植物活性成分與抗生素協同作用

續表1(Continued Tab.1)

3.1 改變抗生素的目標靶點

抗生素目標靶位的突變是細菌產生耐藥性的重要機制之一，細菌可以通過產生替代靶點(如酶或受體)與抗生素結合從而導致抗生素的抗菌活性降低[51]。青霉素結合蛋白(PBPs)是細菌細胞壁的重要組成蛋白，MRSA能產生由mecA基因編碼的替代青霉素結合蛋白(PBP2a)，降低對β-內酰胺類抗生素的親和力，從而呈現出高度耐藥性。植物活性成分可抑制細菌產生PBP2a并增強抗生素與PBPs的結合能力，提高β-內酰胺類抗生素的抗菌活性。Hong等[38]研究發現，1/4 MIC、1/2 MIC濃度的桑黃乙酸乙酯能分別將MRSA的PBP2a產生量降低25.50%～73.66%、0%～4.56%。桑黃乙酸乙酯對PBP2a的產生量呈現出濃度依賴性降低，表明其對PBP2a產生量的抑制作用是主要協同機制。香豆素[37]以及苦丁多酚[52]都能下調mecA基因的表達，從而抑制細胞壁中PBP2a的合成或降低PBP2a的活性，增強β-內酰胺類抗生素與PBPs的結合活性，恢復MRSA對β-內酰胺類抗生素的敏感性。

3.2 抑制抗生素水解/修飾酶的活性

細菌對抗生素耐藥的重要因素之一是產生β-內酰胺酶，這種酶可催化青霉素、頭孢菌素和其他β-內酰胺類抗生素的水解，導致抗生素失活[53]。植物活性成分可通過抑制β-內酰胺酶活性恢復抗生素對細菌的殺菌作用。Cao[54]通過紫外分光光度法測定15種中藥單體對ESBL大腸桿菌產生的β-內酰胺酶活性的抑制作用時發現，蘆薈大黃素、槲皮素、香紫蘇醇、木犀草素、苦參堿、大蒜素和五味子甲素7種中藥單體對β-內酰胺酶有一定的抑制作用，其中抑制效果最佳的為蘆薈大黃素(90 μg/mL)，其抑酶率高達81.7%；苦參堿次之(90 μg/mL)，其抑酶率為71.7%，不同程度的增強了ESBL大腸桿菌對β-內酰胺類抗生素的敏感性。Lee等[49]通過研究EGCG與β-內酰胺類抗生素聯合對70株MDR鮑曼不動桿菌的協同作用時發現，亞抑制濃度的EGCG能使β-內酰胺類抗生素對MDR鮑曼不動桿菌的MIC下降2～512倍，EGCG對β-內酰胺酶的抑制率與對照組相比提高了21.7%。表明EGCG能通過抑制β-內酰胺酶活性顯著增強β-內酰胺類抗生素的抗菌活性。此外，還有研究表明，香豆素[37]、槲皮素[45]、單寧酸[41]等多酚類化合物均能降低抗生素的MIC值，增強β-內酰胺類抗生素對MRSA的抗菌作用，它們的作用機制可能也是抑制了β-內酰胺酶的活性。

3.3 促進膜的滲透性/抑制外排泵的活性

細菌可以通過阻止抗生素進入細胞或以比其流入更快的速度將其泵出細胞來干擾抗生素作用，從而導致抗生素活性降低并產生耐藥性。研究發現，植物活性成分能通過促進膜滲透性、抑制外排泵活性來消減細菌耐藥性。

3.3.1 改變膜的滲透性

細菌可通過減少孔蛋白的生成量、改變孔蛋白的結構、增加細胞壁的厚度等方式降低細胞膜的通透性，導致抗生素通過菌體外膜進入胞內的量減少，進而對抗生素產生耐藥性[53]。植物活性成分能分解革蘭氏陰性菌的油性外膜并增加膜的通透性，當其不能以高濃度到達胞內與疏水性抗生素結合時就會增強細胞膜的滲透性，同時導致細胞內抗生素濃度增加，從而增強抗菌作用。Dhara等[32]通過掃描電鏡觀察肉桂醛與頭孢他啶、環丙沙星聯合對ESBL-QR大腸桿菌和肺炎克雷伯氏菌細胞膜結構的影響，發現聯合作用6 h后細胞質膜破裂、細胞質流失。研究促進孔蛋白基因(ompC、ompF、ompK35和ompK36)轉錄水平發現，促進孔蛋白基因轉錄水平的增加提高了細菌細胞膜的滲透性，促進抗生素流入細胞內，呈現出明顯的協同抗菌作用。植物活性成分對革蘭氏陽性菌細胞膜的通透性也具有增強作用。Amin等[25]發現木犀草素和阿莫西林聯合使用時也可破壞細菌細胞膜的完整性，使其通透性增加，K+外泄，從而導致MRSA細胞數量的減少。此外，Akilandeswari等[55]通過紫外分光光度法測量MRSA在260 nm處細胞裂解后釋放的細胞內容物的吸光度和在590 nm處結晶紫進入MRSA細胞膜的百分比，發現芹菜素與β-內酰胺類抗生素聯合能破壞MRSA細胞質膜并導致細胞內容物泄漏，提高細胞膜的通透性，從而協同抑制MRSA的生長、消減其耐藥性。

3.3.2 抑制/清除生物被膜

生物被膜是粘附在細胞表面的一種胞外聚合物，阻礙抗生素進入細胞內，是細菌產生耐藥性的一個重要因素[56]。植物活性成分能抑制細菌生物被膜的生成或者清除已形成的成熟生物被膜，提高抗生素的滲透率，進而使細菌對抗生素重新敏感。Abu El-Wafa等[57]在研究植物活性成分和不同種類抗生素聯用對MRPA生物被膜的影響時發現，石榴和迷迭香提取物單獨使用對MRPA生物被膜的抑制率分別為91.93%、90.83%，與頭孢他啶(0.002 mg/mL)和慶大霉素(0.002 mg/mL)聯合對成熟生物被膜的清除率分別為97.3%～99.6%、4.3%～98.3%。表明石榴和迷迭香提取物能通過抑制或清除生物被膜與抗生素協同抗菌。Deepika 等[46]報道稱，將1/2 MIC(200 μg/mL)蘆丁與1/4 MIC(2.5 μg/mL)慶大霉素聯合作用對MRPA的生物被膜清除率為85%，顯著增強了慶大霉素的抗生物被膜活性。此外，木犀草素[25]、槲皮素[45]、黃岑苷[40]等黃酮類活性化合物均能顯著抑制MRSA生物被膜的形成，對于MRSA的耐藥性發揮消減作用，使MRSA對抗生素重新敏感。

3.3.3 抑制外排泵活性

外排泵是細菌細胞膜上存在的一類能將抗生素等細胞內容物泵出胞外的蛋白質系統，是細菌耐藥的重要機制之一[47]。植物活性成分能通過抑制外排泵活性這一途徑提高耐藥菌對抗生素的敏感程度。康絲堿(甾體生物堿)能抑制銅綠假單胞菌中的MexAB-OprM外排泵活性，并恢復多種抗生素的抗菌活性[58]。Laudadio等[21]研究表明，小檗堿能通過抑制MexXY-OprM的轉錄表達，從而提高銅綠假單胞菌對氨基糖苷類抗生素的敏感性，很大程度上增強了該類抗生素的抗菌活性。Dwivedi等[39]通過溴化乙錠熒光法測定外排泵活性時發現，裸麥角堿(25.0 mg/mL)與四環素(12.5 mg/mL)聯用可以將MREC的MDR、Tetk等外排基因下調至少3.5倍，并能通過抑制ATP酶活性阻斷外排泵能量來源，同時還將四環素的MIC值降低超過了16倍，顯示出裸麥角堿與四環素之間的協同抗菌作用。另有研究[49]發現，EGCG與美羅培南聯用可大幅度提高β-內酰胺類抗生素對鮑曼不動桿菌的抗菌效果，呈現明顯協同作用，可能的作用機制是EGCG抑制了外排泵活性。Salaheen等[59]研究發現藍莓和黑莓果渣提取物能通過下調外排泵基因(norA、norB、norC、mdeA、sdrM和sepA)2～6倍，從而恢復甲氧西林對MRSA的抑菌活性。其他的天然化合物，例如利血平[48]、辣椒素[23]也被發現可以通過抑制金黃色葡萄球菌的msrA或norA外排基因表達，恢復MRSA對大多數現有抗生素的敏感性。

4 總結與展望

由于抗生素的不合理使用和過量使用，細菌的耐藥問題愈發嚴重威脅著全球生命安全。植物活性成分，如生物堿類、多酚類、萜類等，雖然具有已知和未知的抗菌活性，但是植物活性成分單獨使用發揮抗菌作用的相對周期較長，抗菌活性較弱，使用劑量也較多，可能會導致機體內化合物的蓄積引起中毒或者器官損傷。因此，在臨床和動物養殖中將植物活性成分與抗生素聯合應用研發成協同抗菌制劑，恢復耐藥菌對抗生素的敏感性，減少抗生素和植物活性成分的使用劑量，降低抗生素和植物活性成分帶來的潛在毒副作用，實現減抗降抗的戰略目標。

植物活性成分可以通過改變抗生素的目標靶點、抑制抗生素水解/修飾酶的活性、促進膜的滲透/抑制外排泵的活性等作用機制增強常規抗生素的抗菌活性，為解決細菌的耐藥性問題提供了可行性的策略。盡管植物活性成分能通過不同的作用機制與抗生素協同抗菌，但是抗菌劑在人體與動物體內的代謝存在差異，且人與動物對抗菌劑的反應也不一樣，植物活性成分協同醫用抗生素開發成抗菌劑的標準相對更加嚴苛。因此，對于未來研發出的協同抗菌劑首先進行實驗動物和靶動物的劑量反應(藥效)、毒性和藥代動力學研究，根據動物試驗顯示的藥效作用和毒性以及藥代動力學特性再進行人體臨床試驗研究。臨床上通過藥代動力學特性，半衰期長短，靶器官聚集程度，組織分布特點等評價其有效性，并通過藥效學的相互作用，藥動學相互作用等評價其安全性，以便協同抗菌劑在臨床和動物養殖中安全、廣泛的應用。將來進一步對植物活性成分與抗生素之間的協同抗菌機制進行探究并檢測抗菌劑的殘留，對新型、高效、安全的協同抗菌劑的研發具有重要意義。