基于網絡藥理學和分子對接探討黃芪抗肝癌的作用機制研究

姚 紅，任晉宏，侯宇芯，王禹璇，薛慧清，李青山

山西中醫藥大學 基于炎性反應的重大疾病創新藥物山西省重點實驗室，太原 030619

黃芪為豆科植物蒙古黃芪和膜莢黃芪的干燥根，產于中國東北、華北及西北，具有補氣升陽，益衛固表，利水消腫，消毒排膿之功效[1]。研究表明通過各種癌癥模型和細胞系，已發現黃芪能對腫瘤細胞直接抗增殖或促凋亡作用來縮小或穩定腫瘤[2]。黃芪注射液對不同時期的肝癌均具有一定程度的抑制細胞增殖活性作用，具體機制為,黃芪注射液通過G1/S期阻滯和caspase-9/3途徑激活抑制細胞增殖活性并誘導細胞凋亡，從而抑制肝癌的發展[3]。黃芪注射液中分離得到黃酮類、皂苷類、蒽醌類和芳香烴等其它化合物[4]。總結了近年黃酮類化合物在抗腫瘤作用機制及藥效學方面的進展[5]，其抗肝癌作用靶點及機制尚不完全明確，本文運用網絡藥理學方法搜集出黃芪中潛在的有效物質，并對抗肝癌作用靶點及藥效進行研究，為后期黃芪抗肝癌分子機制的實驗研究提供理論依據。

肝癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，在全球范圍內居第二位。在肝癌的早期階段，手術切除，肝移植，局部消融和其他治療方法可以提高患者的生存率[6]。肝癌是一種多基因疾病，具有復雜的發病機制和信號轉導途徑，單一的治療方式很難取得成功的治療效果。因此，利用靶向藥物調控多種信號通路已成為肝癌治療的新范式[7]。

1 材料

1.1 實驗細胞株

人源肝癌細胞株HepG2為山西中醫藥大學科研實驗中心細胞室保存。

1.2 藥品與試劑

藥品：槲皮素(貨號MB2127：大連美侖生物技術有限公司研制)；山奈酚(貨號MB6888：大連美侖生物技術有限公司研制)；毛蕊異黃酮(貨號MB6778：大連美侖生物技術有限公司研制)；華良姜素(貨號B30148：上海源葉生物科技有限公司)；芒柄花素(貨號485723：大連美侖生物技術有限公司研制)；異鼠李素(貨號S9111：selleckchem)

試劑：胎牛血清與DMEM高糖培養基(美國Gibco)；青-鏈霉素與胰蛋白酶(博士德生物工程有限公司)；MTT與DMSO(北京索萊寶科技有限公司)；Trizol、擴增與逆轉錄試劑盒(日本TaKaRa公司)。

1.3 儀器

生物安全柜、CO2培養箱(新加坡ESCO公司)；離心機(中國中科中佳公司)；熒光定量PCR儀(美國Thermo公司)；Multiskan FC酶標儀(美國賽默飛世爾科技公司)；

2 方法

2.1 數據庫及軟件

本研究使用的數據庫有，PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ ),String (https://string-db.org/cgi/input.pl)，TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，Genecards (https://www.genecards.org)，Uniprot(https://www.uniprot.org)，OMIM(http://www.omim.org)，微生信(www.bioinformatics.com.cn)，PBD(http://www.rcsb.org)，VENNY2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny)，Swiss Target prediction(http://www.swisstargetprediction.ch)，和DAVID 6.7(https://david.ncifcrf.gov)；軟件有GraphPad 5.0；Cytoscape 3.7.2及SYBYL-X 2.0。

2.2 黃芪化學成分篩選及作用靶點預測

運用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP)進行黃芪活性成分的查詢及篩選。以生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、類藥性(drug-like，DL)≥0.18的化合物作為候選成分，查找每個活性成分以Drug Bank為參考范圍的相關靶點。通過Unitprot數據庫規范蛋白靶點名稱。在PubChem數據庫中根據成分名稱查詢相應的SMILES號且在Swiss Target Prediction數據庫根據SMILE號預測活性成分對應的靶點。所有主要活性成分經過預測、檢索和校對去重后，確認與主要活性成分相關的靶蛋白信息。把TCMSP平臺中的靶點與Swiss Target Prediction數據庫中的靶點合并刪除重復值。

2.3 肝癌疾病靶點的預測

利用Genecards數據庫及OMIM數據庫網站檢索以“liver cancer”為關鍵詞，其中Genecards以Relevance score≥20為參考值，獲取疾病肝癌相關的基因。

2.4 黃芪活性成分與關鍵靶點相映射構建核心靶點作用網絡

獲得黃芪活性成分的對應靶點以及肝癌的靶點蛋白之后，取兩者的交集靶點蛋白，在String數據庫繪制蛋白-蛋白相互作用PPI網絡，用Cytoscape 3.7.2軟件進行蛋白網絡結構可視化處理。使用插件CytoNCA來評估交叉點。CytoNCA提供了三種中心度度量來過濾數據，包括度中心度(degree centrality，DC)、接近度中心度(closeness centrality，CC)及中間中心度(betweenness centrality，BC)。首先，對數據進行“DC≥2×DC中位數”的篩選標準，然后通過“DC，BC和CC大于或等于其中位數”的篩選標準將其篩選為核心目標[8]。

2.5 核心靶點基因功能富集和通路富集分析

采用DAVID 6.7數據庫[9]對黃芪抗癌靶點進行基因生物過程(GO)富集分析與信號通路(KEGG)富集分析，限定物種為Homo sapiens，獲得GO功能富集分析結果(P<0.05)及KEGG 信號通路富集分析結果(P<0.05)，利用微生信平臺對KEGG通路和GO富集分析進行可視化分析。利用Cytoscape 3.7.2軟件構建“黃芪成分-靶點-KEGG通路-肝癌” 網絡。

2.6 藥物成分-核心靶點分子對接

篩選出的主要活性成分通過PubChem下載其“SDF”格式，導入SYBYL-X 2.0軟件進行優化修飾；將“1.4”項下篩選的主要蛋白靶點通過PDB數據庫。篩選條件設定如下：1)通過X-晶體衍射獲得蛋白質結構；2)蛋白質的晶體分辨率均方根偏差(RMSD)值越小越好；3)分子對接文獻中報道的蛋白質結構的優先選擇；4)該生物來自Homo sapiens。選擇其最佳蛋白晶體結構，并下載其“pdb”格式文件。導入Surflex-Dock軟件[10]去除小分子配體、所有氨基酸及水分子，尋找蛋白靶點與活性成分靶點的最相接的小分子，對其加氫進行分子對接，通過對接分值來判斷其結合活性。

2.7 MTT法驗證

從山西醫科大學成鐘老師獲得的人肝癌細胞株HepG2復蘇，加入含10%胎牛血清與1%青-鏈霉素的DMEM培養基，放置于37 ℃，5% CO2培養箱中培養。

將HepG2接種到96孔板中，每孔細胞密度為0.8×104個。細胞貼壁后，分別加入100 μmol/L的槲皮素、毛蕊異黃酮、山奈酚、芒柄花素、異鼠李素及華良姜素，培養48 h。前期每孔加入濃度為0.1 mg/mL MTT在37 ℃黑暗中進行4 h的培養，在后期培養中，去除培養基，添加100 μL的DMSO。Multiskan FC酶標儀(檢測吸光度OD值，波長490 nm)。

2.8 RT-qPCR分析

篩選出抑制效果較好的一個化合物進行定量RT-qPCR分析，將HepG2細胞加入3、15、75 μmol/L的華良姜素處理48 h。按照制造商的說明，使用Trizol試劑從HepG2細胞中提取總RNA。逆轉錄試劑盒將提取的RNA轉錄成cDNA。RT-qPCR的步驟如下：在95 ℃預變性15 min，在95 ℃變性10 s，在60 ℃退火20 s，在72 ℃延伸30 s，40個循環。

2.9 數據處理

結果通過統計學軟件GraphPad 5.0進行處理，在方差齊性條件下采用單因素方差分析One-way ANOVA，P<0.05為顯著性差異，P<0.01為極顯著性差異。

3 結果

3.1 黃芪化學成分篩選及作用靶點預測

通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP)檢索黃芪化學成分，以生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30 %、類藥性(drug-like，DL)≥0.18為篩選條件，得到20個黃芪化學成分，如表1，在TCMSP平臺與Swiss Target Prediction數據庫中的靶點，去重后得到202個靶點。

表1 黃芪活性成分信息

續表1(Continued Tab.1)

3.2 肝癌疾病靶點的篩選

以Genecards數據庫及OMIM數據庫進行檢索，分別獲取肝癌相關的疾病靶點1063個和441個，將上述肝癌相關靶基因與202個預測靶基因輸入Venny 2.1.0數據庫取交集和構建韋恩圖(見圖 1)，獲得共同靶基因88個，即黃芪潛在抗肝癌作用靶點。

圖1 黃芪潛在抗肝癌作用靶點篩選Fig.1 Screening of potential anti-liver cancer targets of Astragalus Radix

3.3 蛋白-蛋白互作PPI 網絡構建

將上述88個靶基因上傳至String平臺，物種設定為“Homo sapiens”，其余參數默認，獲得蛋白相互作用數據信息；然后導入Cytoscape 3.7.2軟件中繪制PPI網絡。PPI網絡中共有88個節點(靶基因)通過473條邊發生相互作用(見圖2)。根據degree值來設定節點的大小和顏色深淺，靶基因的degree值越大相對應的節點越大和顏色越深，而2個靶基因之間關系值的評分(combine score)高低則由邊的粗細表示，即combine score越高則邊的線條越粗。使用CytoNCA通過拓撲分析對PPI網絡的交叉點進行了中央網絡評估，根據DC≥31、BC≥0.056和CC≥0.595 5總共篩選了6個潛在的核心目標(見表2)。通過拓撲與PPI分析結果表明TP53、MAKP1、AKT1、IL6、MAPK8及VEGFA可以被認為是黃芪抗肝癌的關鍵靶基因。且六個靶點相對應的黃芪活性成分有槲皮素、山奈酚、毛蕊異黃酮、芒柄花素、異鼠李素與華良姜素(如表3)。

表2 6個潛在核心目標的拓撲參數

圖2 黃芪潛在抗肝癌靶點 PPI 網絡Fig.2 Astragalus Radix potential anti-liver cancer target PPI network

表3 關鍵靶點所對應的化合物

續表3(Continued Tab.3)

3.4 核心靶點GO功能富集和KEGG通路富集分析

將黃芪治療肝癌88個靶點上傳至DAVID生物信息在線數據庫進行GO富集分析，以P<0.05作為蛋白質生物學功能具有顯著性的反應，確定GO分析總數為487條，其中生物學過程(biological process，BP)372條，主要涉及序列特異性DNA結合轉錄因子活性的正向調控、凋亡過程的負調控、RNA聚合酶II啟動子的轉錄正調控、炎癥反應、細胞周期調節、細胞增殖調節等；細胞成分(cell component，CC)48條，涉及細胞核、細胞細胞質、細胞外空間、核染色質、RNA聚合酶II轉錄因子復合物等；分子功能(molecular function，MF)67條，與蛋白磷酸酶結合、染色質結合、轉錄調控DNA結合、細胞因子活性、MAP激酶活性等相關。均取排名靠前的10個條目作圖(見圖3)。

圖3 黃芪活性成分潛在抗肝癌靶點的生物過程分析柱狀圖Fig.3 A histogram of the biological process analysis of the potential anti-liver cancer targets of the active ingredients of Astragalus Radix

黃芪抗癌靶點獲得KEGG通路富集分析，得到100條通路(P<0.05)，按富集基因數目排序后取前20條信號通路作圖(見圖4)。黃芪抗肝癌的主要靶點主要涉及PI3K-Akt 信號通路(20個靶點占23%)、Hepatitis B信號通路(15個靶點占18%)、HIF-1信號通路(13個靶點占16%)及腫瘤壞死因子TNF信號通路(13個靶點占16%)等。研究報道山奈酚通過下調AKT和FAK通路抑制腎癌細胞的侵襲和遷移[11]。黃芪提取物[12]通過PI3K/AKT/mTOR途徑抑制細胞增殖和誘導細胞凋亡，證實了黃芪提取物的抗腫瘤作用。

圖4 黃芪抗肝癌關鍵靶點參與的通路富集信息柱狀圖Fig.4 A histogram of information enrichment of pathways involved in key targets of Astragalus Radix anti-liver cancer

為了系統和全面地解釋黃芪抗肝癌的作用機制，使用Cytoscape軟件構建了藥物化合物-核心靶點-通路-疾病網絡(見圖5)。結果如圖5所示，6個黃芪主要活性成分節點、6個靶基因，20個KEGG信號通路節點。節點與節點的邊代表發生相互作用的活性成分、肝癌靶基因和通路之間的聯系，這些途徑與6中心靶標緊密相互作用。

圖5 “黃芪-成分-靶點-KEGG通路-疾病”網絡Fig.5 "Astragalus Radix-components-targets-KEGG pathway-disease" network

3.5 活性成分-關鍵靶點分子對接

基于PPI網絡的分析，選取黃芪中6個活性成分與6個核心靶點進行分子對接。在PDB數據庫得蛋白ID編號為3q05(TP53)、1unq(AKT1)、4nif(MAPK1)、4nci(IL6)、4yr8(MAPK8)及4zff(VEGFA)。一般認為，Dock系統對接分數>4.25時，表明分子與靶點之間存在結合活性，對接分數>5.0證明結合活性較高，對接分數>7.0說明兩者存在強烈的結合活性[13]，對接分數≥7.0的活性成分利用Surflex-Dock軟件繪制氫鍵圖和飄帶圖(見圖6)，由圖可見，槲皮素與TP53在SER-241、ARG-248、ARG-273、VAL-274、ALA-276、CYS-277和ARG-280處形成氫鍵；與MAPK1在THR-110、MET-108、LYS-114、ASP-111、GLN-105、ILE-103和LYS-54處形成氫鍵；異鼠李素與TP53在SER-240/SER-241、ARG-273、VAL-274、THR-284、ALA-276和ARG-280處形成氫鍵；與MAPK1在ASP-111、LYS-151、ASP-167，AR-67和ALA-35處形成氫鍵；與MAPK8在ARG-192、HIS-230、ASN-284和SER-249處形成氫鍵；山奈酚與MAPK1在THR-110、LYS-114、ASP-111、AEG-67、GLY-37、LYS-151和ASP-167處形成氫鍵；芒柄花素與MAPK1在LYS-54和SER-153處形成氫鍵；毛蕊異黃酮與MAPK1在ASP-167、ARG-67和LYS-114處形成氫鍵。華良姜素與MAPK1在LYS-54、LYS-151、LYS-153、ASP-111和LYS-114處形成氫鍵。

圖6 黃芪活性成分-核心蛋白對接模式Fig.6 Astragalus Radix active ingredient-core protein docking mode注：a：槲皮素與TP53對接圖(7.432 0)；b：槲皮素與MAPK1對接圖(7.034 0)；c：山奈酚與MAPK1對接圖(8.090 7)；d：異鼠李素與TP53對接圖(8.513 4)；e：異鼠李素與MAPK1對接圖(8.806 8)；f：異鼠李素與MAPK8對接圖(7.095 5)；g：芒柄花素與MAPK1對接圖(7.684 2)；h：毛蕊異黃酮與MAPK1對接圖(8.468 0)；i：華良姜素與MAPK1對接圖(7.794 4)。Note: a: Docking diagram of quercetin and TP53 (7.432 0);b: Docking diagram of quercetin and MAPK1 (7.034 0);c: Docking diagram of kaempferol and MAPK1(8.090 7);d: Docking diagram of isorhamnetin and TP53 (8.513 4);e: Docking diagram of isorhamnetin and MAPK1(8.806 8);f: Docking diagram of isorhamnetin and MAPK8(7.095 5);g: Docking diagram of formononetin and MAPK1 (7.684 2);h: Docking diagram of calycosin and MAPK1 (8.468 0);i: Docking diagram of jaranol and MAPK1(7.794 4).

3.6 MTT法

分子對接結果探究這6種黃芪活性成分對肝癌細胞HepG2的影響，采用MTT法初步篩選。在同一濃度下，與對照組相比，發現華良姜素對HepG2細胞抑制作用較強于其他五種活性成分(見圖7)，且P<0.001，表明華良姜素對HepG2細胞抑制作用有顯著性差異，選出華良姜素進行后續實驗分析。

圖7 黃芪6個活性成分對HepG2細胞的影響Fig.7 The effect of active components from Astragalus Radix on HepG2 cells注：與對照組相比，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。O：對照組；A：山奈酚；B：毛蕊異黃酮；C：槲皮素；D：芒柄花素；E:：異鼠李素；F：華良姜素。Note: Compared with control,*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001.O: Control group;A: Kaempferol;B: Calycosin;C: Quercetin;D: Formononetin;E:Isorhmnetin;F: Jaranol.

3.7 RT-qPCR分析

通過熒光定量PCR檢測TP53、MAPK1、AKT1、IL6、MAPK8與VEGFA基因的mRNA在加不同濃度的華良姜素后表達水平變化(見圖8)，6個基因均出現上調趨勢，隨著給藥劑量的增加，mRNA的表達量增多。且給藥組中高劑量基因變化有極顯著(P<0.01)性差異。由此說明華良姜素對肝癌HepG2細胞有抑制作用

圖8 不同濃度的華良姜素對6個基因mRNA表達含量Fig.8 Different concentrations of Jaranol on the mRNA expression of 6 genes注：與對照組相比，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。a：APK1蛋白；b：MAPK8蛋白；c：IL6蛋白； d：TP53蛋白；e：VEGFA 蛋白；f：AKT1蛋白。Note: Compared with control,*P < 0.05;**P < 0.01;***P < 0.001.a: MAPK1 protein;b: MAPK8 protein;c: IL6 protein;d: TP53 protein;e: VEGFA protein;f:AKT1 protein.

4 討論

黃芪是一種常用的補氣藥，研究表明黃芪提取物可能是一種潛在的抗腫瘤藥物。道地藥材恒山黃芪的多糖成分具有抑制人宮頸癌細胞Si Ha的增殖、粘附、鋪展以及遷移運動的活性[14]。槲皮素是一種天然植物類黃酮，其生物活性已得到廣泛研究，對白血病，乳腺癌，肝癌，卵巢癌，結直腸癌，胃癌和子宮內膜癌的惡性細胞生長具有明顯的抑制作用[15]。經研究報道槲皮素通p53/Bcl-xl增強阿霉素介導的抗肝癌作用[16]。山萘酚通過下調miR-21和上調PTEN以及滅活PI3K/AKT/mTOR信號通路來抑制HepG2細胞的增殖，遷移和侵襲[17]。毛蕊異黃酮與異阿魏酸配伍組合是通過細胞周期調控因子cyclin D1、CDK6和p21介導的細胞周期調控來抑制HepG2細胞增殖[18]。

本研究通過TCMSP 篩選出黃芪20個有效成分，成分靶點與疾病靶點交集出88個共同靶點。經PPI網絡與拓撲分析篩選出6個關鍵蛋白及相對應的6個單體化合物，經上述分子對接分數可知。成分與靶點具有一定的結合性，MAPK8/Fox O信號通路對于癌癥和脂肪肝的發展非常重要。研究證實他莫西芬通過MAPK8/Fox O信號通路在乳腺癌細胞(MCF-7、T47D、ZR-75和MDA-MB-231)和肝細胞(LO2)中起作用。通過干擾MAPK8/Fox O信號傳導途徑誘導脂肪肝[19]。He等[20]研究表明，用脂多糖誘導乳腺炎小鼠，檢測到MAPK信號通路中p38MAPK、ERK和JNK的磷酸化水平升高，參與炎癥反應。黃芪蛋白通過影響p53信號通路導致HepG2細胞發生程序性壞死,從而導致肝癌細胞的生長受到抑制[21]。

靶點富集分析表明：黃芪可能通過凋亡過程的負調控、ATP結合、蛋白質復合物等生物功能及PI3K-Akt 信號通路、Hepatitis B信號通路、HIF-1信號通路及腫瘤壞死因子信號通路起抗肝癌作用。MTT結果顯示6個化合物均對肝癌HepG2細胞有一定地抑制作用，RT-qPCR結果顯示不同濃度的華良姜素均能使6個基因呈上調趨勢，且與PI3K-Akt 信號通路、Hepatitis B信號通路、HIF-1信號通路及腫瘤壞死因子信號通路所涉及的基因一致。已確定PI3K-Akt信號通路在許多人類癌癥中差異表達。例如，PIK3R1在肝細胞癌和腎癌中起抑癌作用[22]。Wu等[23]發現 TNF-α單體干預肝癌細胞中NF-κB活化，可使細胞凋亡增加，siRNA可通過特異性抑制NF-κB/p65編碼的mRNA，下調P-gp水平，促進肝癌細胞凋亡。Chen 等[24]研究發現HBp / FOXO3 / miRNA-30b-5p / MINPP1軸通過糖酵解旁路促進HBV陽性HCC細胞的發育。還提出了miRNA-30b-5p / MINPP1作為HBV陽性HCC早期診斷的新型生物標志物和抗腫瘤治療的潛在藥物靶標。

基于網絡藥理學與分子對接，本研究闡述了中藥黃芪治療肝癌的有效活性成分、潛在作用靶點及發揮藥效的生物學通路。實驗驗證為后續研究其藥理作用機制實驗驗證奠定基礎。