核桃分心木鎮(zhèn)靜催眠活性成分研究

洪茜茜，耿樹香，張銀志，孫秀蘭，徐德平*

1江南大學(xué)食品學(xué)院，無(wú)錫 214122；2云南省林業(yè)科學(xué)院，昆明 650201

核桃分心木(Diaphragma Juglandis Fructus,DJF)，又稱核桃隔膜、核桃瓣膜。核桃分心木的傳統(tǒng)藥用用途包括治療和預(yù)防糖尿病[1,2]、腎虛、腹瀉和泌尿生殖系統(tǒng)疾病。體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)除了傳統(tǒng)的補(bǔ)腎作用外，分心木還具有鎮(zhèn)靜催眠[3]、抗氧化[4,5]、抗炎[6]、抗腫瘤[7]等作用，可應(yīng)用于保健食品、醫(yī)藥等相關(guān)領(lǐng)域的產(chǎn)品開發(fā)。

在全球范圍內(nèi)，大約10%～15%的成年人患有慢性失眠，而另外25%～35%的人則患有短暫性或偶發(fā)性睡眠障礙[8]。除了影響日常生活質(zhì)量和工作效率外，這些障礙還會(huì)導(dǎo)致各種健康和社會(huì)經(jīng)濟(jì)問題[9]。在失眠的傳統(tǒng)治療方法中，藥物治療是最常用，如苯二氮卓類藥物和非苯二氮卓類藥物等處方藥會(huì)發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠作用以改善患者的病情；但是，長(zhǎng)期使用可能會(huì)導(dǎo)致習(xí)慣化和戒斷癥狀[10,11]。面對(duì)這些限制，人們傾向于尋求有效安全且副作用更少的天然藥物來治療或減輕失眠癥狀。

目前針對(duì)分心木鎮(zhèn)靜催眠活性研究多集中于粗提物，未能定位到具體功能成分。Zhao[12]發(fā)現(xiàn)分心木水提物能縮短戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的小鼠入睡潛伏時(shí)間、延長(zhǎng)睡眠持續(xù)時(shí)間、趨勢(shì)性降低自主活動(dòng)。本文利用小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的睡眠實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)分離方向，通過柱層析和薄層色譜逐步分離出具有鎮(zhèn)靜催眠活性的單體化合物，核磁共振技術(shù)鑒定其結(jié)構(gòu)。研究結(jié)果可為核桃分心木資源的開發(fā)利用提供理論依據(jù)，增加核桃資源附加值。

1 材料與試劑

1.1 材料及試劑

核桃分心木(云南省林業(yè)科學(xué)院)。

無(wú)水乙醇、濃硫酸、茴香醛、冰醋酸(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；戊巴比妥鈉(成都貝斯特試劑有限公司)；艾司唑侖(常州四藥制藥有限公司)。

SPF級(jí)雄性ICR小鼠(維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)。

1.2 設(shè)備及儀器

AB-8型(天津南開大學(xué)化學(xué)工廠)；ODS填料(Nacalai Tosoh Inc)；MCI GEL填料(Mitsubishi Chemical Corporation)。核磁共振儀(Avance 500 MHz,Bruer公司)；DS-2CD2TDY-14mm型網(wǎng)絡(luò)攝像機(jī)(杭州海康威視數(shù)字技術(shù)股份有限公司)； Ethovision 11.5行為學(xué)計(jì)算機(jī)軟件分析系統(tǒng)(Intetro 曠場(chǎng)，諾達(dá)斯信息技術(shù)責(zé)任有限公司)。

2 方法

2.1 核桃分心木提取物制備及粗分離

稱取核桃分心木10 kg，粉碎后過40目篩，置于100 L提取罐，按1∶10(kg∶L)料液質(zhì)量體積比加入體積分?jǐn)?shù)70%乙醇，60 ℃條件下攪拌提取4 h，過濾，取濾液，濾渣按上述方法再次醇提，收集濾液并與第一次濾液合并，減壓濃縮至適宜體積，即為分心木乙醇提取物，-20 ℃下冷凍保存。分心木醇提后的濾渣中水提兩次，收集濾液減壓濃縮至膏狀物，即為分心木水提物。

取適量分心木水提物，加入3倍體積的無(wú)水乙醇，并且不斷攪拌使得濃縮液充分醇沉，靜置過夜，水提醇沉相(A)經(jīng)干燥得到固態(tài)顆粒于-20 ℃下冷凍保存，水提醇溶相減壓濃縮至適宜體積和醇提物合并，即為分心木混合提取物。取適量分心木混合提取物上AB-8型大孔樹脂柱(10 cm×150 cm)，依次用水和30%、50%、70%的乙醇進(jìn)行梯度洗脫，薄層色譜法(thin-layer chromatography，TLC)跟蹤監(jiān)測(cè)洗脫液中的成分，并根據(jù)TLC檢測(cè)結(jié)果將具有相同成分的洗脫液合并，將洗脫液分成B(水洗脫)、C(30%和50%洗脫)和D(70%洗脫)3個(gè)部分。分別減壓濃縮后，-20 ℃下冷凍保存。

2.2 核桃分心木粗組分鎮(zhèn)靜催眠功效的研究

將60只SPF級(jí)4周齡雄性ICR小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為6組，每組10只。空白組和試驗(yàn)組以1.0 g/kg·bw劑量分別灌胃溶劑、A、B、C、D，陽(yáng)性對(duì)照組以2 mg/kg·bw艾司唑侖灌胃。連續(xù)灌胃14天后，展開試驗(yàn)。試驗(yàn)在25 ℃左右安靜環(huán)境下進(jìn)行。

2.2.1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

使用由4個(gè)活動(dòng)空間組成的4個(gè)單元(每個(gè)單元50 cm×50 cm×38 cm)的曠場(chǎng)迷宮進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每次檢測(cè)4只鼠。實(shí)驗(yàn)前用酒精將曠場(chǎng)空間擦干凈，樣品組給藥30 min后(陽(yáng)性對(duì)照組給藥15 min)開始實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)時(shí)輕輕抓住鼠尾，將鼠放在每個(gè)單元曠場(chǎng)迷宮的中間，讓小鼠在迷宮內(nèi)適應(yīng)5 min，之后點(diǎn)擊軟件開始按鈕激活軟件，跟蹤鼠移動(dòng)路徑，以10 min內(nèi)運(yùn)動(dòng)平均速度、運(yùn)動(dòng)時(shí)間和中央?yún)^(qū)域停留時(shí)間為指標(biāo)，使用EthoVision XT 11軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。每次試驗(yàn)結(jié)束，清理尿液和糞便，并使用5%～10%的乙醇噴灑在迷宮底面和內(nèi)壁，用紙巾擦拭干凈，消除小鼠遺留的氣味后再測(cè)試下一組小鼠，避免氣味和殘留物對(duì)下一只小鼠的影響[13]。

2.2.2 直接觀察睡眠實(shí)驗(yàn)

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)束次日晚進(jìn)行直接睡眠觀察。灌胃30 min后，監(jiān)控?cái)z像觀察并記錄灌胃后12 h內(nèi)各組小鼠的睡眠時(shí)間[14]。

2.2.3 戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的睡眠實(shí)驗(yàn)

在正式實(shí)驗(yàn)前先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)確定戊巴比妥鈉腹腔注射劑量，以腹腔注射后全部小鼠入睡且睡眠持續(xù)時(shí)間適中的劑量為標(biāo)準(zhǔn)，并以此劑量(為50 mg/kg·bw)進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。小鼠末次灌胃30 min后通過腹腔注射戊巴比妥鈉誘導(dǎo)睡眠，小鼠睡眠潛伏期記錄為戊巴比妥鈉注射后至翻正反射消失的時(shí)間，以翻正反射消失至再次出現(xiàn)的時(shí)間記錄為小鼠睡眠時(shí)間[15]，觀察各組潛伏期是否縮短，睡眠時(shí)間是否延長(zhǎng)。

2.3 大孔樹脂洗脫活性組分的分離及鎮(zhèn)靜催眠功能的測(cè)定

將具有鎮(zhèn)靜催眠功能的B組分上樣到MCI柱(5 cm×100 cm)，依次用水，10%、30%和50%的乙醇進(jìn)行梯度洗脫，流速15 mL/min，自動(dòng)收集器每管20 mL收集洗脫液，用TCL法跟蹤監(jiān)測(cè)洗脫液中的成分，并根據(jù)Rf值和顯色反應(yīng)的結(jié)果合并相同組分，得到B-1(水洗脫)、B-2(10%和30%洗脫)、B-3(50%洗脫)三個(gè)組分。

2.4 MCI柱洗脫組分鎮(zhèn)靜催眠功效的研究

按2.2方法對(duì)MCI柱分離得到的B-1、B-2、B-3組分進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)，分析各組分鎮(zhèn)靜催眠的作用。

2.5 具有鎮(zhèn)靜催眠活性的單一成分的分離與結(jié)構(gòu)鑒定

將具有鎮(zhèn)靜催眠功能的B-1組分反復(fù)上樣到ODS色譜柱，直至得到4個(gè)單體成分，用重水(D2O)或氘代二甲亞砜(DMSO-d6)溶解進(jìn)行1H NMR和13C NMR等光譜數(shù)據(jù)分析，確定其結(jié)構(gòu)。

2.6 單體化合物鎮(zhèn)靜催眠的功效

將單體化合物按“2.2”的方法進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)，判定其鎮(zhèn)靜催眠的功效。

2.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)。使用SPSS 20軟件單向方差分析(ANOVA)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)評(píng)估。P< 0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

3 結(jié)果

3.1 大孔樹脂粗組分鎮(zhèn)靜催眠活性分析

3.1.1 鎮(zhèn)靜活性分析

從表1曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)表明，與空白組相比，陽(yáng)性對(duì)照組和B組均顯著降低了小鼠的運(yùn)動(dòng)速度和運(yùn)動(dòng)時(shí)間(P<0.05)，其中陽(yáng)性對(duì)照組顯著降低增加了小鼠在中央?yún)^(qū)域的停留時(shí)間(P<0.05)。而其他組分較之空白組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表1 核桃分心木粗組分對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)速度、運(yùn)動(dòng)時(shí)間以及中央?yún)^(qū)域停留時(shí)間的影響

3.1.2 催眠活性分析

如表2所示，從灌胃后12 h內(nèi)睡眠總時(shí)長(zhǎng)來看，各實(shí)驗(yàn)組較之空白組均有所增加，且僅B組和陽(yáng)性對(duì)照組極顯著(P< 0.01)。另外，戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的睡眠實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，B組和陽(yáng)性對(duì)照組分別使睡眠潛伏期縮短了24.62%(P<0.05)和25.88%(P<0.05)，同時(shí)令睡眠時(shí)長(zhǎng)延長(zhǎng)了61.49%(P<0.05)和254.19%(P< 0.01)。

表2 核桃分心木粗組分對(duì)小鼠自然情況12 h睡眠時(shí)長(zhǎng)、戊巴比妥鈉誘導(dǎo)睡眠的潛伏期和睡眠時(shí)間的影響

由上述結(jié)果可知，B組為分心木中鎮(zhèn)靜催眠的活性部位，對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的分離。

續(xù)表2(Continued Tab.2)

3.2 MCI洗脫各組分鎮(zhèn)靜催眠活性分析

3.2.1 鎮(zhèn)靜活性分析

由表3可知，與空白組相比，B-1組雖未顯著降低小鼠的運(yùn)動(dòng)速度(降低了15.87%)，但使得運(yùn)動(dòng)時(shí)間減少了17.17%(P<0.05)，中央?yún)^(qū)域的停留時(shí)間增加了57.85%(P<0.05)。

表3 MCI洗脫各組分對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)速度、運(yùn)動(dòng)時(shí)間以及中央?yún)^(qū)域停留時(shí)間的影響

3.2.2 催眠活性分析

如表4所示，從灌胃后12 h內(nèi)睡眠總時(shí)長(zhǎng)來看，B-1、B-2、陽(yáng)性對(duì)照組的睡眠總時(shí)長(zhǎng)分別增加了36.4%(P<0.05)、11.99%、49.77%(P<0.01)，而B-3組睡眠時(shí)長(zhǎng)有所降低。B-1組和陽(yáng)性對(duì)照組分別使睡眠潛伏期縮短了21.87%(P<0.05)和27.21%(P<0.05)，同時(shí)令睡眠時(shí)長(zhǎng)延長(zhǎng)了49.09%(P<0.05)和281.30%(P< 0.01)。

表4 MCI洗脫各組分對(duì)小鼠自然情況12 h睡眠時(shí)長(zhǎng)、戊巴比妥鈉誘導(dǎo)睡眠的潛伏期和睡眠時(shí)間的影響

綜合上述結(jié)果，B-1組為鎮(zhèn)靜催眠的有效組分，對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化。

3.3 單體化合物的鑒定

具有鎮(zhèn)靜催眠活性的B-1組分經(jīng)進(jìn)一步的分離得到4個(gè)單體化合物。

化合物1白色無(wú)定形粉末，易溶于水;從1H NMR(500 MHz，D2O)譜可見，氫信號(hào)集中在3～4之間，且無(wú)端基氫信號(hào)，故推測(cè)為糖類化合物。13C NMR譜共顯示6個(gè)碳信號(hào)，結(jié)合135DEPT可見，無(wú)端基碳信號(hào)，且δC62.9(C-1)、72.6(C-2)、74.1(C-3)、70.0(C-4)、71.1(C-5)、62.4(C-6)。經(jīng)文獻(xiàn)對(duì)比[16,17]，分析該化合物為2-羥甲基-四氫吡喃-3，4，5-三醇，又稱1，5-脫水-D-葡萄糖醇。

化合物2白色無(wú)定形粉末，易溶于水;從1H NMR(500 MHz，D2O)譜可見，共有5個(gè)氫信號(hào)，其中δH6.63(1H，s)、4.07(1H，s)、3.86(1H，s，J= 4.0 Hz)、2.79(1H，d，J=15.0 Hz)、2.63(1H，dd，J=8.0,7.5 Hz)，其中δH4.07為連氧碳的氫信號(hào)，δH2.79和2.63為-CH2-的氫信號(hào)；13C NMR譜共顯示4個(gè)碳信號(hào)，分別為δC181.2(-COOH)、135.5、70.2、42.5。135DEPT譜圖可知，δC135.5為-CH-的碳信號(hào)，根據(jù)化學(xué)位移推斷-CH-以雙鍵與亞氨基相連，δC70.2為連氧碳信號(hào)，δC42.5為-CH2-的碳信號(hào)。經(jīng)文獻(xiàn)對(duì)比[18]，分析該化合物為3-羥基-4-亞氨基丁酸。

化合物3淡黃色粉末，可溶于水、乙醇和甲醇;從1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)譜可見，δH4.38(1H，d，J=4.5 Hz)為葡萄糖上的端基H信號(hào)，δH3.15(1H，t，J= 8.5 Hz)，δH3.00(1H，t，J= 8.5 Hz)表明有2個(gè)-CH-，δH3.07～4.38為糖上的H信號(hào)，1.06(3H，m)，1.01(3H，m)表明有2個(gè)甲基存在，δH4.17(1H，t，J= 4.0 Hz)表明存在-OH，且相鄰碳上有氫；13C NMR譜共顯示10個(gè)碳信號(hào)，δ100.79為葡萄糖端基碳信號(hào)，δC77.8、73.5、70.3、69.1、61.2為葡萄糖的其余碳信號(hào)，δC76.8、76.7為-CH-的碳信號(hào)，δC19.1、14.7為-CH3信號(hào)。通過端基碳信號(hào)和氫信號(hào)的偶合常數(shù)表明葡萄糖為α構(gòu)型。經(jīng)文獻(xiàn)對(duì)比[19]，分析該化合物為(1′-甲基-2′-羥基)丙烷-O-α-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物4白色粉末，易溶于水、乙醇等，不溶于氯仿;從1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)譜可知，δH6.84(1H，d，J= 8.5 Hz)和7.01(1H，d，J= 7.0 Hz)為連有羥基碳的鄰位碳上的氫。δH5.45(1H，d，J= 5.0 Hz)和5.14(1H，d，J= 5.0 Hz)為兩個(gè)葡萄糖端基H信號(hào)，葡萄糖6＇位上的兩個(gè)質(zhì)子分別在δH3.50和3.54，δH3.18～3.44為糖上的其他質(zhì)子信號(hào)。13C NMR譜顯示共有22個(gè)碳信號(hào)，其中12個(gè)碳為糖中的碳，且δC101.5和103.5為端基碳信號(hào)。δC148.8、149.0、153.3為萘環(huán)上的連氧碳信號(hào)，δC126.9和128.0為兩苯環(huán)連接處的碳信號(hào)，δC109.3～115.7為萘環(huán)上的-CH-信號(hào)。通過端基碳信號(hào)和氫信號(hào)的偶合常數(shù)表明兩個(gè)葡萄糖均為β構(gòu)型。經(jīng)文獻(xiàn)對(duì)比[20]，分析該化合物為6-羥基萘基-1，2-(2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷)。

3.4 單體化合物鎮(zhèn)靜催眠活性分析

3.4.1 鎮(zhèn)靜活性分析

單體化合物的鎮(zhèn)靜結(jié)果見表5。與空白組相比，化合物1、3、4未表現(xiàn)出顯著性差異；化合物2則顯著降低了小鼠的運(yùn)動(dòng)速度和運(yùn)動(dòng)時(shí)間(P<0.05)，增加了小鼠在中央?yún)^(qū)域的停留時(shí)間(P<0.01)。

表5 單體化合物對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)速度、運(yùn)動(dòng)時(shí)間以及中央?yún)^(qū)域停留時(shí)間的影響

3.4.2 催眠活性分析

如表6所示，化合物1和2以及陽(yáng)性對(duì)照組12 h內(nèi)的睡眠總時(shí)長(zhǎng)較之空白組均有所增加，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的睡眠實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，化合物1未能縮短潛伏期，但可延長(zhǎng)睡眠時(shí)間；化合物2使睡眠潛伏期縮短了24.62%(P<0.05)，且使睡眠時(shí)長(zhǎng)延長(zhǎng)了61.49%(P<0.05)。化合物3相較于空白組無(wú)明顯差異。化合物4雖使得小鼠睡眠潛伏期縮短，但對(duì)其睡眠時(shí)長(zhǎng)幾乎無(wú)影響。

表6 單體化合物對(duì)小鼠自然情況12 h睡眠時(shí)長(zhǎng)、戊巴比妥鈉誘導(dǎo)睡眠的潛伏期和睡眠時(shí)間的影響

綜上所述，化合物1僅具有延長(zhǎng)小鼠睡眠時(shí)間的功能，而化合物2則具有鎮(zhèn)靜催眠活性。

4 討論與結(jié)論

目前已被明確研究的天然鎮(zhèn)靜催眠成分有糖類，類黃酮，木脂類和香豆素以及皂苷等[21]，含有糖類、黃酮類、木脂素類、酚類、皂苷類的分心木可能在鎮(zhèn)靜催眠方面具有良好的療效。本研究探討了核桃分心木的鎮(zhèn)靜催眠作用及其功效成分。在評(píng)估鎮(zhèn)靜和催眠活性的藥理學(xué)方法中，曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的睡眠實(shí)驗(yàn)是兩種經(jīng)典的行為方法。在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中測(cè)得的小鼠平均運(yùn)動(dòng)速度、時(shí)間等通常被認(rèn)為是控制睡眠活動(dòng)的重要指標(biāo)[22]。本研究表明，化合物2能減少正常小鼠的平均運(yùn)動(dòng)速度以及時(shí)間，增加在中央?yún)^(qū)域停留的時(shí)間。此外，戊巴比妥鈉(短期鎮(zhèn)靜劑和催眠藥)誘發(fā)的睡眠試驗(yàn)中獲得的潛伏期和睡眠持續(xù)時(shí)間也通常用作評(píng)估物質(zhì)鎮(zhèn)靜催眠作用的指標(biāo)[23]。化合物1未能縮短潛伏期，但可延長(zhǎng)睡眠持續(xù)時(shí)間；化合物2可縮短睡眠潛伏期，延長(zhǎng)睡眠持續(xù)時(shí)長(zhǎng)。且兩者均能增加自然條件下小鼠12 h內(nèi)的睡眠時(shí)長(zhǎng)。其中化合物2(3-羥基-4-亞氨基丁酸)具有顯著鎮(zhèn)靜催眠的活性，可能是因?yàn)槠浣Y(jié)構(gòu)與γ-氨基丁酸類似，因而具有類似的活性。

據(jù)報(bào)道，具有鎮(zhèn)靜催眠功能活性的中藥有效成分發(fā)揮作用的機(jī)理有：(1)調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)遞質(zhì)。神經(jīng)遞質(zhì)不僅在正常的睡眠清醒節(jié)律調(diào)節(jié)中起著重要作用，而且在紊亂的過程中也發(fā)揮著重要的作用。如五味子乙素B通過增加下丘腦5-HT和γ-氨基丁酸水平在對(duì)氯苯丙氨酸致失眠大鼠模型中發(fā)揮催眠作用[24]。(2)影響睡眠相關(guān)細(xì)胞因子，如膽囊收縮素、食欲素和其他內(nèi)源性物質(zhì)。曾雪愛等發(fā)現(xiàn)松郁安神方的鎮(zhèn)靜催眠作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)下丘腦內(nèi)源性睡眠促進(jìn)物質(zhì)PGD2含量有關(guān)[25]。故化合物1和2可能是通過以上2種途徑發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠作用，具體是哪種作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

核桃分心木提取物大孔樹脂水洗脫組分具有鎮(zhèn)靜催眠的活性，該組分經(jīng)MCI分離后，有效組分集中在MCI水洗脫物中，對(duì)其進(jìn)一步分離得到4個(gè)單體化合物，分別為2-羥甲基-四氫吡喃-3，4，5-三醇(1)、3-羥基-4-亞氨基丁酸(2)、(1′-甲基-2′-羥基)丙烷-O-α-D-吡喃葡萄糖苷(3)、6-羥基萘基-1，2-(2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷)(4)。本文通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)初步判斷2-羥甲基-四氫吡喃-3，4，5-三醇僅具有延長(zhǎng)小鼠睡眠時(shí)間的功效，3-羥基-4-亞氨基丁酸則具有鎮(zhèn)靜催眠的功能活性。上述研究為分心木應(yīng)用于治療失眠提供了理論支持，為其后續(xù)的保健食品藥品的開發(fā)、鎮(zhèn)靜催眠功效的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。