樸樹內生鐮刀菌HU0174抗真菌次生代謝產物研究

李曉潔，李豐名，徐良雄，李 玲*，彭永宏,*

1華南師范大學生命科學學院，廣州 510631；2惠州學院生命科學學院，惠州 516007

病原真菌侵染是導致采后果蔬腐爛的主要原因之一[1]，不僅造成重大經濟損失，部分真菌還會產生真菌毒素，對人的生命安全造成潛在威脅[2]。抗真菌劑的使用可以大大抑制采后果蔬病害的發生和發展[3,4]，然而，越來越多的研究和實踐表明殺菌劑的大規模長期使用會導致病原菌耐藥性增強[5]。同時，隨著人們對健康和環保的意識不斷提高，更安全、低毒和低殘留的新型天然抗真菌劑的研發越來越受到關注[6]。

鐮刀菌屬真菌是一類廣泛分布的真菌，既可產伏馬霉素、T-2毒素等真菌毒素，也可產生物堿、肽、酰胺、萜類、醌類和吡喃酮類等結構多樣且具潛在藥用價值的代謝產物[7]。在前期植物內生菌的抗菌活性篩選中，發現一株植物內生鐮刀菌Fusariumsp.HU0174大米發酵物對柑橘綠霉拮抗活性較好。為此，采用天然產物化學方法對該菌大米發酵物中的次生代謝產物進行分離、鑒定和抗真菌活性評價。

1 材料與方法

1.1 菌種

鐮刀菌Fusariumsp.HU0174由惠州學院生命科學學院徐良雄副研究員等于2018年5月分離自惠州市惠東縣黃埠圩附近的樸樹(CeltissinensisPers.)枝條，經ITS測序比對和形態觀察鑒定為鐮刀菌屬(Fusariumsp.)真菌，現保藏于惠州學院天然產物化學實驗室菌種庫。植物病原菌柑橘綠霉(Penicilliumdigitatum)和新月彎孢霉(Curvularialunata)由中國科學院華南植物園段學武研究員贈予，黑曲霉(Aspergillusniger)和黃曲霉(A.flavus)由本實驗室分離鑒定。

1.2 儀器和試劑

YMP200中壓快速純化制備系統(天津博納艾杰爾公司)；LC-16P高效液相色譜儀和LC-MS-8040電噴霧質譜儀(日本Shimadzu公司)；Quantum-I核磁共振波譜儀(武漢中科牛津波譜公司)；Bio TOF IIIQ高分辨質譜儀(德國Bruker公司)；IP-digi300/3+數字全自動旋光儀(上海儀邁儀器科技有限公司)。甲醇等分析純試劑(天津大茂化學試劑廠)；核磁用氘代試劑(美國劍橋公司)；柱層析硅膠(青島基億達硅膠試劑有限公司)；C18反相硅膠(日本富士硅化學株式會社)；Sephadex LH-20葡聚糖凝膠(瑞典Amersham Biosciences公司)。抗真菌劑百可得(40%)(江蘇龍燈化學有限公司)。

1.3 菌株的發酵

挑取活化好的菌株菌絲于3 mL PDB培養基，28 ℃、150 rpm培養3天，制得一級種子液；取2 mL一級種子液轉移至200 mL PDB培養基中，相同條件下培養3天，制得二級種子液；取5 mL二級種子液均勻接種于大米固體培養基(含60 g大米和60 g自來水)，28 ℃黑暗靜置培養56天。

1.4 提取與分離

發酵物以95%乙醇浸提3次，提取液過濾后濃縮除去乙醇后分別以石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取。經抗柑橘綠霉活性評價后，在活性追蹤的指導下對具活性的乙酸乙酯萃取部位的代謝產物進行分離和純化。所得乙酸乙酯部(81.2 g)進行正相硅膠(100～200目)柱層析，石油醚-丙酮(100∶0→50∶50)梯度洗脫得流份Fr.1～12。流份Fr.4經HPLC純化，60%甲醇水洗脫得化合物6(32.6 mg，tR= 19.4 min)。流份Fr.8經中壓反相硅膠柱層析，甲醇-水(40%→90%)梯度洗脫得流份Fr.8-1～ Fr.8-20。流份Fr.8-4經HPLC純化，50%甲醇水洗脫得化合物7(9.4 mg，tR= 12.0 min)；流份Fr.8-20經HPLC純化，80%甲醇水洗脫得化合物2(12.6 mg，tR= 67.0 min)和5(6.9 mg，tR= 44.0 min)。流份Fr.9經大孔吸附樹脂柱層析，40%、60%和90%乙醇-水依次洗脫，得到流份Fr.9-1～6。流份Fr.9-5經HPLC純化，82%甲醇水洗脫得到化合物3(7.4 mg，tR= 37.2 min)、4(3.8 mg，tR= 30.4 min)和1(6.5 mg，tR= 19.0 min)。

1.5 化合物的結構鑒定

單體化合物以氘代溶劑溶解，采集其核磁共振數據；以色譜甲醇溶解，直接進樣采集其電噴霧質譜數據。通過綜合分析其波譜數據并比對文獻，鑒定化合物結構。

1.6 抗真菌活性測試

采用濾紙片瓊脂擴散法評價單體化合物的抗真菌活性。測試真菌孢子以無菌水稀釋至約1×106個/mL，均勻涂布于PDA培養基上；化合物以甲醇溶解后加至濾紙片上，每濾紙片載樣量為200 μg，以百可得為陽性對照，載樣量分別為0.30、0.15、0.078、0.039 μg，甲醇為陰性對照。定期觀察測試菌生長情況，并測量抑菌圈半徑。

2 結果與分析

2.1 結構鑒定

HR-ESI-MS結果顯示該化合物的分子式為C43H69O11N7。其13C NMR譜(氘代甲醇為溶劑)檢測到43個碳信號，其中包括8個酯羰基碳信號(δC177.7、176.0、175.3、174.1、173.4、173.2、173.0、172.1)；6個鄰位或對位取代苯環的碳信號[δC157.4、131.4(2C)、128.7、116.3(2C)]；8個連氧或氮的碳信號(δC77.4、68.3、60.2、59.7、55.8、55.0、51.6、51.1)。1H NMR譜顯示該化合物存在對位取代苯環上質子信號[δH7.04(2H，d，J= 8.6 Hz)、6.70(2H，d，J= 8.6 Hz)]；存在8個連在雜原子上的質子信號[δH4.83(1H，m)，4.58(1H，t，J= 7.5 Hz)，4.33(1H，d，J= 7.4 Hz)，4.31(1H，d，J= 8.1 Hz)，4.22(1H，t，J= 6.6 Hz)，4.18(1H，d，J= 7.4 Hz)，4.14(1H，m)，3.85(1H，d，J= 8.4 Hz)]，7個甲基質子信號[δH1.46(3H，d，J= 7.4 Hz)，1.42(3H，d，J= 6.9 Hz)，1.33(3H，s)，1.01(3H，d，J= 6.7 Hz)，0.92(3H，t，J= 6.5 Hz)，0.88(3H，d，J= 6.9 Hz)，0.84(3H，t，J= 7.4 Hz，3H)]，此外，在δH1.31～1.20存在12個長鏈烷烴質子信號。結合上述13C NMR譜和1H NMR譜分析結果，推測該化合物可能是由6個氨基酸與1個脂肪酸鏈組成的寡酯肽。環肽薄層層析特征顯色結果還顯示該化合物為環肽[8]。通過對比化合物1與同時分離自該菌的acuminatum B(3)的13C NMR譜數據發現，兩者氨基酸殘基和酯羰基相關碳信號基本一致，但化合物1在δC30.6附近比acuminatum B少2個碳信號，δH1.31～1.20區間中也少4個質子信號，且HR-ESI-MS顯示其分子量比acuminatum B少28 Da。此外，采用氘代DMSO采集的1D NMR數據(見表1)和1H-1H COSY、HMBC相關譜(見圖2)進一步驗證了上述判斷，說明化合物1的酯基部分為3-羥基-4-甲基-十二烷酸(3-hydroxy-4-methyldodecanoic acid，HMDA)。基于其與acuminatums A～C(2～4)具有相同的生源，以及相近的比旋光度值，推測它們的立體構型相同，化合物1化學結構如圖1所示，是一個新的acuminatum類衍生物，命名為acuminatum D。化合物1的詳細結構鑒定原始圖譜可從本刊官網免費下載(www.trcw.ac.cn)。

圖1 化合物1～7的化學結構Fig.1 The chemical structures of compounds 1-7

圖2 化合物1的1H-1H COSY和關鍵HMBC相關Fig.2 1H-1H COSY and key HMBC correlations of compound 1

表1 化合物1的1H(400 MHz)和13C(100 MHz)NMR數據

續表1(Continued Tab.1)

922[M+Cl]-。1H NMR(400 MHz，CD3OD)：D-allo-Thr：δ4.30(1H，d，J= 8.0 Hz，H-2)，4.16(1H，m，H-3)，1.29(3H，d，J= 6.3 Hz，H-4)；L-Ala-1：δ4.35(1H，q，J= 7.0 Hz，H-2)，1.40(3H，d，J= 7.0 Hz，H-3)；D-Ala-2：δ4.15(1H，q，J= 7.3 Hz，H-2)，1.44(3H，d，J= 7.3 Hz，H-3)；L-Gln：δ4.21(1H，t，J= 7.6 Hz，H-2)，2.22(2H，m，H-4)，2.05(2H，m，H-3)；D-Tyr：δ7.02(2H，d，J= 8.5 Hz，H-5，9)，6.68(2H，d，J= 8.5 Hz，H-6，8)，4.55(1H，t，J= 7.6 Hz，H-2)，2.98(1H，dd，J= 13.6，7.6 Hz，H-3)，2.90(1H，dd，J= 13.6，7.6 Hz，H-3)；L-Leu：δ4.30(1H，d，J= 8.0 Hz，H-2)，1.76(2H，m，H-3)，1.44(1H，m，H-4)，0.90(3H，d，J= 6.4 Hz，H-5)，0.83(3H，d，J= 6.9 Hz，4-CH3)；HMTA：δ4.77(1H，m，H-3)，2.59(1H，m，H-2)，2.53(1H，m，H-2)，1.77(1H，m，H-4)，1.59(1H，m，H-5)，1.27～1.23(16H，m，H-6～13)，1.10(1H，m，H-5)，0.98(3H，d，J= 6.8 Hz，4-CH3)，0.89(3H，t，J= 7.1 Hz，H-14)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)：D-allo-Thr：δ173.2(C-1)，68.4(C-3)，60.4(C-2)，20.9(C-4)；L-Ala-1：δ176.0(C-1)，51.1(C-2)，17.6(C-3)；L-Ala-2：δ175.3(C-1)，51.6(C-2)，17.1(C-3)；L-Gln：δ177.8(CONH2)，173.8(C-1)，54.9(C-2)，32.7(C-4)，27.8(C-3)；D-Tyr：δ174.0(C-1)，157.3(C-7)，131.4(C-5，9)，128.7(C-4)，116.2(C-6，8)，55.7(C-2)，38.5(C-3)；L-Leu：δ172.9(C-1)，53.5(C-2)，40.7(C-3)，25.7(C-4)，23.0(4-CH3)，22.5(C-5)；HMTA：δ172.0(C-1)，77.4(C-3)，39.4(C-2)，36.1(C-4)，33.5(C-5)，33.1(C-12)，30.9(C-7)，30.8(C-8)，30.8(C-9)，30.7(C-10)，30.5(C-11)，27.2(C-6)，23.7(C-13)，16.0(4-CH3)，14.4(C-14)。對比文獻[9-12]，化合物2鑒定為acuminatum A。

化合物5白色粉末；ESI-MS：m/z784[M+H]+，806[M+Na]+，782[M-H]-。1H NMR(400 MHz，CD3OD)Me Phe-1/2/3：δ7.27(4H，d，J= 4.2 Hz，H-5，6，8，9)，7.20(1H，dt，J= 8.4，4.2 Hz，H-7)，5.80(1H，dd，J= 12.8，4.6 Hz，H-2)，3.41(1H，dd，J= 14.9，4.6 Hz，H-3)，3.16(3H，s，H-10)，3.06(1H，dd，J= 14.9，12.8 Hz，H-3)，Leu-1/2/3：δ4.87(1H，m，H-2′)，1.81(1H，m，H-3′)，0.86(3H，d，J= 6.7 Hz，H-4′)，0.29(3H，d，J= 6.7 Hz，H-5′)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)：Me Phe-1/2/3：δ173.2(C-1)，138.0(C-4)，129.8(C-5、6、8、9)，128.0(C-1)，57.9(C-2)，35.4(C-3)，31.2(C-10)。對比文獻[15]，化合物5鑒定為白僵菌素。

化合物6白色固體；ESI-MS：m/z262[M+H]+，284[M+Na]+，260[M-H]-，557[2M+Cl]-。1H NMR(400 MHz，CDCl3)：δ7.33(1H，m，H-14)，7.33(1H，m，H-15)，7.32(1H，m，H-13)，7.14(1H，d，J= 3.4 Hz，H-16)，7.13(1H，d，J= 2.3 Hz，H-12)，4.40(1H，t，J= 4.5 Hz，H-3)，3.28(1H，dd，J= 18.6，4.5 Hz，H-10)，3.20(1H，dd，J= 18.6，4.5 Hz，H-10)，3.02(3H，s，H-17)，2.97(3H，d，J= 2.2 Hz，H-6)，2.31(1H，m，H-7)，0.85(1H，d，J= 7.1 Hz，H-8)，0.77(1H，d，J= 6.5 Hz，H-9)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)：δ167.4(C-2)，165.7(C-5)，134.3(C-11)，129.9(C-12)，129.9(C-16)，129.4(C-13)，129.4(C-15)，128.3(C-14)，81.4(C-6)，62.9(C-3)，37.2(C-10)，32.6(C-17)，29.8(C-7)，18.7(C-8)，15.3(C-9)。對比文獻[16]，化合物6鑒定為白僵菌酮。

化合物7黃色粉末；ESI-MS：m/z160[M-H]-。1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：8.06(1H，dd，J=7.1，1.7 Hz，H-4)，7.94(1H，s，H-2)，7.43(1H，dd，J= 7.1，1.6 Hz，H-7)，7.17(1H，dd，J= 7.1，1.4 Hz，H-5)，7.17(1H，dd，J= 7.1，1.4 Hz，H-6)；13C NMR：(100 MHz，CD3OD)δ：169.3(C-8)，138.2(C-7a)，133.4(C-2)，127.6(C-3a)，123.6(C-6)，122.3(C-5)，122.0(C-4)，112.9(C-7)，108.8(C-3)。對比文獻[17]，化合物7鑒定為吲哚-3-羧酸。

2.2 抗真菌活性

濾紙片瓊脂擴散法評價結果顯示(見表2)，載樣量為200 μg時，化合物acuminatums A～D(1～4)對柑橘綠霉和新月彎孢霉顯示出較強的抑制效果，而對黑曲霉和黃曲霉無明顯抑制活性，其余化合物對所有測試的真菌均無明顯抑制作用。

表2 化合物1～4的抗真菌活性(抑菌圈半徑，mm)

3 討論

環肽類微生物源抗真菌劑具有易降解、低殘留的特點，其中納他霉素(natamycin)已經作為天然抑菌劑在多個國家和地區廣泛應用食品領域。環酯肽類化合物具有抗菌、抗腫瘤等生物活性[18]，越來越引起人們的廣泛關注。環酯肽類化合物在抗細菌活性方面研究較為成熟，有些已經用于臨床，其中包括抗生素粘菌素(colistin)和達托霉素(daptomycin)可分別用于治療多重耐藥性革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌引起是疾病[19,20]。在抗真菌活性方面研究相對較少，其中包括clavariopsins A和B對白色念珠菌、煙曲霉和黑曲霉表現出抑制作用，MIC值分別為8、4和16 μg/mL[20,21]；verlamelins A和B對芒果炭疽病菌表現較強的抑制作用，其MIC值分別為4.9和9.8 μg/mL[22]。有研究表明acuminatum B、C對蘋果黑星菌、蘋果鏈核盤菌和水稻旋胞腔菌表現出很強的拮抗活性[13]，且表現出相同的MIC值，分別為1、1、10 μg/mL，同時acuminatum B同系物fusaripeptide A對白色念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌以及煙曲霉都表現很強的抑制作用，IC50為0.11～0.24 μM，略低于兩性霉素B[23]。

本研究從樸樹內生鐮刀菌Fusariumsp.HU0174大米發酵物的乙酸乙酯部位分離鑒定了7個化合物，包括5個環酯肽和2個雜環類化合物，其中化合物1為新化合物，豐富了鐮刀菌次生代謝產物的多樣性。抗真菌活性結果顯示，環酯肽類化合物acuminatum A～D(1～4)在200 μg時對柑橘綠霉和新月彎孢霉有抑制作用，但是對黑曲霉和黃曲霉均無抑制活性，說明化合物acuminatum類環酯肽的真菌拮抗活性具有較強的特異性，初步闡明了鐮刀菌Fusariumsp.HU0174的抗真菌活性物質基礎，對新型微生物源的抗真菌劑的研發具有一定的參考價值。