響應面法優化藜麥麩皮皂苷最佳提取工藝及其α-葡萄糖苷酶抑制活性

董 琦，譚 亮，胡 娜,2，王洪倫,2*

1中國科學院西北高原生物研究所 中國科學院藏藥研究重點實驗室；2青海省藏藥研究重點實驗室，西寧 810008；3中國科學院大學，北京 100049

藜麥(ChenopodiumquinoaWilld.)原產于南美洲安第斯山區，是印加土著居民的主要傳統食物，具有5 000～7 000多年的食用和種植歷史[1]。藜麥具有豐富的營養價值，其富含總酚與黃酮醇，具有抗氧化、免疫調節及抗癌活性[2,3]。20世紀60年代初，我國開始引進藜麥資源。近幾年來，我國藜麥種植面積迅速擴大，2019年全國藜麥種植面積估計超過2萬hm2，總產量可達到2～3萬噸[4]。藜麥麩皮(即藜麥的外種皮)中含有大量三萜皂苷，但皂苷味苦。食用藜麥之前常通過水洗或者研磨去除[5]，所以藜麥實際生產加工過程中會產生大量的藜麥麩皮，但目前對藜麥麩皮的利用僅是簡單加工處理用作飼料[6]，如果可以利用藜麥麩皮，就能提高藜麥的綜合利用價值。三萜皂苷具有抗炎、抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化和抗糖尿病等活性[7,8]，除此之外，已有文獻報道藜麥麩皮中白蛋白具有抗氧化和ACE抑制活性[9]，其50%乙醇提取物通過激活抗氧化酶系統和阻斷TGF-β1途徑對四氯化碳誘導的小鼠肝損傷和纖維化具有保護作用[10]，同時有研究發現未加工藜麥中的多酚及皂苷提取物對α-葡萄糖苷酶均具有較高的抑制活性[11]。

目前有關藜麥麩皮總皂苷的超聲提取工藝尚未見相關文獻報道。本實驗以藜麥麩皮為實驗材料，對超聲提取總皂苷的工藝進行優化。在單因素實驗的基礎上，選擇液料比、乙醇濃度、超聲時間和超聲溫度為自變量，以藜麥麩皮總皂苷的提取得率作為響應值，采用響應面法優化得到藜麥麩皮總皂苷的超聲提取最佳工藝。本實驗同時考察了最佳提取工藝條件下提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制活性。同時建立酶反應動力學方程對其抑制動力學進行分析，探討了藜麥麩皮提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制機制，從而挖掘藜麥麩皮作為α-葡萄糖苷酶抑制劑的開發潛力，為藜麥麩皮的進一步開發利用提供理論基礎和數據支撐。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

藜麥麩皮，粉末狀，是由白藜麥機械脫去的麩皮制得(由青海博基生物技術有限公司提供)。

α-葡萄糖苷酶(G5003，100UN，來源于酵母，美國Sigma公司)；4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG，阿拉丁試劑(上海)有限公司)；阿卡波糖及齊墩果酸對照品(上海源葉科技有限公司)；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

KQ-100B型超聲波清洗儀(昆山超聲儀器有限公司)；EPOCH2型酶標儀(BioTek公司)；BE-9010型恒溫振蕩器(THOMMO SHAKER)；Cary 300Bio型紫外-可見分光光度計(美國安捷倫公司)。

1.3 方法

1.3.1 總皂苷含量的測定

采用比色法測定總皂苷的含量[12]，并在此基礎上略做改動。準確移取0.20 mL樣品溶液于10 mL具塞試管中，置于70 ℃水浴上揮去溶劑，分別依次加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，搖勻，置于60 ℃水浴加熱15 min，取出后立即用冷水冷卻數分鐘，加入4 mL乙酸乙酯，搖勻，以不加標準品溶液和樣品溶液的平行樣為空白，在560 nm下測定吸光值，重復3次，以齊墩果酸為標準品，得回歸方程為y= 11.892x+ 0.070 9，r= 0.999 6，結果顯示質量在0.010 8～0.108 mg/mL范圍內線性關系良好。根據標準曲線計算溶液中皂苷的濃度，然后根據公式計算出樣品中總皂苷的提取得率，按式(1)計算：

(1)

其中，C：根據標準曲線計算溶液中總皂苷的質量濃度(mg/mL)；d：稀釋倍數；V：定容體積(mL)；M：稱取的樣品質量(g)。

1.3.2 藜麥麩皮皂苷提取工藝優化

1.3.2.1 單因素實驗

準確稱取1.0 g藜麥麩皮粉末，選擇液料比、乙醇濃度、超聲時間和超聲溫度四個因素，以其中一項因素改變時，其他因素不變進行單因素實驗。各單因素變量分別是：液料比(5、10、15、20、25 mL/g)、乙醇濃度(50%、60%、70%、80%、90%)，超聲時間(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h)和超聲溫度(40、50、60、70、80 ℃)，提取次數均為3次。

1.3.2.2 響應面優化

在單因素實驗結果的基礎上，選取液料比(A)、乙醇濃度(B)、超聲時間(C)和超聲溫度(D)為考察因素，以總皂苷提取得率為響應值，采用響應面法進行Box-Behnken中心組合設計，用Design Expert 8.0進行實驗數據分析，進而優化藜麥麩皮總皂苷的提取工藝。

1.3.3α-葡萄糖苷酶抑制活性測定

將藜麥麩皮總皂苷提取物配制成不同濃度的樣品溶液。采用參考文獻[13]方法并作適當調整，以基于pNPG的體外評價模型進行檢測。實驗分為空白組、空白對照組、樣品空白組和樣品組，各反應物在96孔板中加樣20 μL，每組3個平行，分別加入80 μL 0.1 mmol/L 磷酸緩沖溶液(pH6.8)，空白對照組和樣品空白組加入50 μL 0.1 mmol/L 磷酸緩沖溶液(pH6.8)，其他各組加入50 μLα-葡萄糖苷酶磷酸緩沖溶液(1 U/mL)，在恒溫振蕩器中37 ℃保溫30 min后取出，加入50 μL 0.5 mmol/L pNPG溶液，充分混勻，于37 ℃水浴反應20 min，結束后加入50 μL 0.1 mol/L的Na2CO3溶液中止反應。在405 nm處測定吸光值，根據式(2)計算出各樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制率。以阿卡波糖為陽性對照，繪制藥物濃度與對酶的抑制率的關系曲線，求出相應的IC50值。

(2)

其中，AC：空白組吸光值；AB：空白對照組吸光值；AS：樣品組吸光值；ASB：樣品空白組吸光值。

1.3.4α-葡萄糖苷酶抑制的抑制動力學分析

按照“1.3.3”方法分別測定不同濃度藜麥麩皮總皂苷提取物與酶濃度分別為0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 U/mL時反應的初速度，底物最終濃度為0.5 mmol/L，每個濃度做3個平行孔，以酶濃度[E](U/mL)為橫坐標，反應初速度ν(ΔOD/min)為縱坐標作圖，利用圖的特征推斷酶的結合方式。藜麥麩皮總皂苷提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制類型由Linewaver-Burk方法確定[14]。配制不同濃度的藜麥麩皮總皂苷提取物，與濃度分別為0.125、0.25、0.5、1.0、2.5 mmol/L的底物溶液，混勻，加入1 U/mLα-葡萄糖苷酶溶液，測定α-葡萄糖苷酶抑制的反應速率V。按Lineweave-Burk方程，以底物濃度的倒數1/[S]為橫坐標，1/V為縱坐標繪制抑制作用動力學曲線，確定抑制類型。

1.3.5 統計分析

2 結果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 液料比對提取得率的影響

改變液料比，而其他參數不變，探討液料比對藜麥麩皮總皂苷提取得率的影響。結果如圖1A所示。從圖中可以看出，在液料比為15 mL/g時總皂苷的提取得率達到最高。因此，選擇液料比為5、15、25 mL/g為響應面設計的三個水平。

2.1.2 乙醇濃度對提取得率的影響

改變乙醇濃度，而其他參數不變，探討乙醇濃度對藜麥麩皮總皂苷提取得率的影響。結果如圖1B所示。從圖中可以看出，在乙醇濃度為80%時總皂苷的提取得率達到最高，而后隨著乙醇濃度的增加總皂苷提取得率有所降低。因此，選擇乙醇濃度為60%、80%、100%為響應面設計的三個水平。

圖1 液料比(A)、乙醇濃度(B)、超聲時間(C)、超聲溫度(D)對藜麥麩皮皂苷提取得率的影響Fig.1 Effects of liquid-solid ratio (A),concentration of ethanol (B),ultrasonic time (C),ultrasonic temperature (D) on saponin extraction yield of quinoa bran

2.1.3 超聲時間對提取得率的影響

改變超聲時間，而其他參數不變，從而探討超聲時間對藜麥麩皮總皂苷提取得率的影響。結果如圖1C所示。從圖中可以看出，在超聲時間為1.5 h時總皂苷的提取得率達到最高，而后隨著超聲時間的增加總皂苷提取得率有所降低。因此，超聲時間為1.0、1.5、2.0 h為響應面設計的三個水平。

2.1.4 超聲溫度對提取得率的影響

改變超聲溫度，而其他參數不變，從而探討超聲溫度對藜麥麩皮總皂苷提取得率的影響。結果如圖1D所示。從圖中可以看出，在超聲溫度為60 ℃時總皂苷的提取得率達到最高，而后隨著超聲溫度的增加總皂苷提取得率逐漸降低。因此，超聲溫度為40、60、80 ℃為響應面設計的三個水平。

2.2 響應面實驗結果與分析

根據單因素實驗結果，響應面實驗因素水平及編碼如表1所示，以總皂苷提取得率為響應值(Y)，響應面設計方案及結果如表2所示。

表1 響應面分析因素及水平表

表2 Box-Behnken實驗設計與結果

利用Design Expert 8.0.6 軟件對表2實驗數據進行回歸分析，獲得響應面方差分析及顯著性結果如表3所示。

表3 響應面方差分析

因素交互作用對藜麥麩皮總皂苷提取得率的影響見圖2。以藜麥麩皮總皂苷提取得率為響應值(Y)，得到總皂苷提取量對各影響因素的二次多項式回歸模型為：Y=2.20+0.071×A-0.14×B+0.094×C-0.38×D-0.060×AB+0.010×AC+ 0.072×AD-0.080×BC+0.027×BD-0.062×CD-0.33×A2-0.51×B2-0.44×C2-0.29×D2。

圖2 因素交互作用對藜麥麩皮總皂苷提取得率的影響Fig.2 Factors interaction effects on total saponins extraction yield from quinoa bran

經統計學分析可知，該實驗選用的模型極顯著(P<0.01)，表明模型選擇合適；失擬項P>0.05，說明該模型擬合度好。根據表3顯示，在此實驗設計中，超聲溫度(D)對藜麥麩皮總皂苷提取得率的影響達到了極顯著水平(P< 0.01)。從顯著性檢驗P值的大小可以得到各因素對藜麥麩皮總皂苷提取得率影響的順序為超聲溫度(D)> 乙醇濃度(B)> 超聲時間(C)>液料比(A)。

通過回歸模型求解方程，得到最佳的提取條件為：液料比15.52 mL/g，76.62%乙醇超聲提取，超聲時間1.59 h，超聲溫度46.46 ℃。結合到實際操作的局限性，對該條件進一步的完善，即液料比15 mL/g，75%乙醇超聲提取，超聲時間1.5 h，超聲溫度45 ℃。經過3次重復性實驗驗證，得到總皂苷提取得率為2.37% ± 0.022%，與預測值2.35%的相對誤差為0.85%，說明實際結果與預測值比較差異性較小，表明此響應面法得到的回歸模型具有較好的可靠性。

2.3 藜麥麩皮提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

采用優化后的提取工藝得到的藜麥麩皮總皂苷提取物，對α-葡萄糖苷酶抑制作用結果見圖3。實驗結果表明，總皂苷提取物的抑制作用明顯強于陽性藥阿卡波糖(P< 0.05)，其IC50值分別為0.620 ± 0.057 mg/mL和0.851 ± 0.053 mg/mL。推測藜麥麩皮中皂苷類化合物可能是其發揮酶抑制作用的主要活性成分。已有研究表明藜麥麩皮中的黃酮和酚類物質具有抑制糖苷酶作用[15]。而藜麥麩皮中皂苷類物質對葡萄糖苷酶的抑制作用未見文獻報道，有望從其中分離得到安全、有效的α-葡萄糖苷酶抑制劑。

圖3 總皂苷提取物(A)和阿卡波糖(B)對α-葡萄糖苷酶抑制作用Fig.3 Inhibitory effect of total saponins extract (A) and acarbose (B) on the activity of α-glucosidase

2.4 藜麥麩皮總皂苷提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制機制分析

在不同提取物濃度的存在下，改變酶的濃度，通過剩余酶活力對不同濃度的酶作圖得到一組直線(圖4)。所有的直線有很好的線性關系，且都經過原點。另外，隨著提取物濃度的增加，直線的斜率在減小，說明藜麥麩皮提取物濃度的存在，沒有改變酶的數量，而是降低了酶的活性。因此，藜麥麩皮總皂苷提取物對α-葡糖糖苷酶的抑制作用是可逆的。

圖4 藜麥麩皮總皂苷提取物酶濃度與反應初速率圖Fig.4 Relationship between enzyme concentration and initial reaction velocity of total saponins extract from quinoa bran

2.5 藜麥麩皮總皂苷提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制動力學研究

為了評估總皂苷提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制機制，進行了酶動力學研究。按 Lineweaver-Burk雙倒曲線作圖法，分別作出藜麥麩皮總皂苷提取物和阿卡波糖酶抑制動力學曲線，確定抑制類型和抑制常數。如圖5和6所示，結果顯示總皂苷提取物濃度越大，直線斜率越大，而所有直線相交于第一象限，說明藜麥麩皮總皂苷提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用屬于混合競爭性抑制。而阿卡波糖所有直線與Y軸幾乎相交于一點，說明阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶屬于競爭性抑制，這與文獻報道一致[13]。

圖5 藜麥麩皮總皂苷提取物的Lineweaver-Burk雙倒曲線Fig.5 Lineweaver-Burk plot of total saponins extract from quinoa bran

圖6 阿卡波糖Lineweaver-Burk雙倒曲線Fig.6 Lineweaver-Burk plot of acarbose

3 結論

本文采用響應面法優化了藜麥麩皮超聲提取皂苷的最佳工藝為液料比15 mL/g，75%乙醇超聲提取，超聲時間1.5 h，超聲溫度45 ℃，得到總皂苷提取得率為2.370% ± 0.022%。該工藝條件簡單，操作控制容易，穩定性好，克服了常規方法提取時間長需要加熱處理操作步驟繁瑣等缺點。

α-葡萄糖苷酶抑制活性實驗表明，藜麥麩皮總皂苷提取物抑制活性明顯強于市售α-葡萄糖苷酶抑制劑阿卡波糖(P< 0.05) ，有望從其中分離得到安全、有效的α-葡萄糖苷酶抑制劑。抑制機制和酶動力學研究表明，藜麥麩皮總皂苷提取物是一種可逆的混合性抑制類型，這為明確藜麥麩皮提取物的降低餐后血糖作用機制提供了參考，為其高值化利用提供數據基礎和技術支撐。此外，藜麥麩皮對α-葡萄糖苷酶抑制作用的活性物質基礎以及體內活性等可以通過分離制備和相關的動物模型的建立來進一步研究。